mRNワクチンの生産には、プラスミドDNA（pDNA）鋳型から始まり、続いてそれが直鎖化されてRNAに転写させて生産していきます。
詳しくは、メルク社のmRNAワクチン・mRNA治療薬の製造戦略などをご覧ください。
mRNワクチンの生産で除去が必要な不純物は、プラスミドDNA（pDNA）鋳型の精製（制限酵素、ウシ血清アルブミン（BSA）、DNA断片、エンドトキシンなどの不純物の除去）も必要になりますが、できたmRNAの精製も重要になります。
『in vitro転写ステップ後、不純物およびエンドトキシン、免疫原性のある二本鎖 RNA（dsRNA）、残存する鋳型DNA、RNA ポリメラーゼ、元素不純物などを含有する前工程で使用した材料からmRNAを精製します。この段階では、mRNAは、TFF、酵素によるキャップ付加、および／またはクロマトグラフィーステップに適したバッファーに溶解されている必要があります。mRNAの精製および残留DNAの除去にはいくつかの選択肢があります：
タンジェンシャルフローフィルトレーション（TFF） は、膜に保持されない小さな不純物からmRNAを効率的に分離するために使用されます。通常、鋳型DNAは、DNaseの添加によって分解されます。その結果得られる小さなDNA断片は、TFFを用いて大きなmRNA分子から容易に分離できます。mRNA のサイズに基づいて、30～300 kDaの分子量カットオフを使用することができます。TFFを使用すると、同じ操作で対象物質の精製、濃縮およびダイアフィルトレーションが可能です。しかし、小さなDNA断片がmRNAとハイブリダイズして、新たな不純物を生成する可能性があり、これは鋳型DNAを除去するキャプチャーを使用すれば回避できます。3
クロマトグラフィー技術、例えば逆相イオン対（IPRP）クロマトグラフィー、陰イオン交換（AEX）クロマトグラフィー、poly(dT)をキャプチャー用分子として用いるアフィニティークロマトグラフィー（AC）など（図3）は、鋳型DNAを効率的に除去する手段を提供することで、鋳型DNA消化の必要性や、限外ろ過／ダイアフィルトレーションのステップでハイブリダイゼーションが発生するリスクを排除します。1 クロマトグラフィーは、酵素によるキャップ付加のステップ後にも、不要な生成物やオリゴヌクレオチド不純物を除去するために使用されます。しかし、クロマトグラフィーは高コストであり、メディア（充填剤）交換や後続ステップの前処理として、やはりTFFが必要となります。
逆相イオン対クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによるmRNA精製の比較（DBC：動的結合容量）4,5
図3.逆相イオン対クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによるmRNA精製の比較（DBC：動的結合容量）4,5
逆相イオン対クロマトグラフィー（IPRP）は、一般に小規模生産に使用されます。この手法は、極めて効率的かつ迅速にRNAを精製でき、DNA、二本鎖RNA（dsRNA）および短い転写産物から一本鎖RNA（ssRNA）を良好に分離できます。この方法の欠点としては、溶媒を使用するためGMP製造設備での生産に向いていないこと、イオン対試薬によりmRNAとの複合体が形成されるためその除去にダイアフィルトレーションが必要となること、タンパク質や凝集体によるファウリングが生じやすいためキャプチャーよりポリッシングに向いていること、などが挙げられます。
陰イオン交換クロマトグラフィー（AEX）は、動的結合容量が大きく（10 mg RNA/mL以上）、免疫原性のある不純物（dsRNA、キャップ付加されていないRNA、RNA-DNAハイブリッド、その他のヘアピンmRNAなどのRNA構造など）を極めて高い効率で除去できます。AEXでは水溶液を使用できますが、レジンに結合した高分子量のmRNAを脱着させるために、毒性を発揮する可能性のあるカオトロピック剤の使用や最高85°Cまでの昇温が必要となる場合があります。常温で溶出するのは通常、500塩基未満のmRNAです。5
アフィニティークロマトグラフィー（AC） poly (dT)をキャプチャー用分子として用いるアフィニティークロマトグラフィーには、完全長mRNA転写産物のポリ (A) 鎖を特異的にキャプチャーするレジンを使用します。このプロセスにより、DNA、ヌクレオチド、酵素、バッファー成分およびポリ(A) 鎖を持たないその他のあらゆる不純物が効率的に除去されます。AEXと同様、水溶液を使用することができ、ACの場合、一般に塩濃度勾配が使用されます。IPRPやAEXとは異なり、ACではdsRNAとssRNAを区別できず、mRNAにハイブリダイズしたDNA断片などのその他の生成物に関連する不純物の除去に対して効果的ではありません。このため、一般的なアプローチとしては、最初のクロマトグラフィーステップはACですが、それに続いて、ポリッシングのためにAEXが使用されます。
最終濃縮とダイアフィルトレーション は、クロマトグラフィーの各ステップに続いて実行して、製剤純度を最大限に高めて、製剤用または保存用の適切なバッファーにmRNAを移します。この段階では、同じ操作でmRNAの精製、濃縮およびダイアフィルトレーションが可能です。このTFFステップの後に滅菌ろ過を実行できます。ただし、注意すべき点として、分子量が5000 kDa以上のmRNAについては、滅菌グレードでろ過することが難しい場合があります。
Bancel S, Issa J, Aunins J, Chakraborty T. 2014. Manufacturing methods for production of rna transcripts (Patent No. WO2014152027A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152027A1/en
4.
Issa J, Barberio J, Aunins J, Aefyan N. Ion exchange purification of mRNA (Patent No. WO2014144767A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014144767A1/en
5.
Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, Shi Y, Sadtler K, Gao W, Lin J, et al. 2019. Delivery of mRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cell activation. Nat Biotechnol. 37(10):1174-1185. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0247-3
』
つまりあなたが注射されたコロナワクチンにどれだけの不純物が含まれていたか、今となってはわからないかもしれません。しかも何回もワクチン接種されていれば、いつどんな不純物が悪さしていてもわからないはずです。ワクチン接種する場合は接種前後の体調変化をしっかりと記録しておく必要があります。体調に明らかに変化があればわかりますが、精神的な変化はわかりにくいかもしれません。
