三谷幸喜脚本の2004年の大河ドラマ。当時は低視聴率だったけど印象としてはイケメンだらけの男子校
の青春群像劇という感じだった。当時でもすごかったが今改めて見るとものすごいキャスト陣である
近藤勇（こんどう いさみ）
（島崎勝太 → 近藤勇）
演：香取慎吾
局長。多摩の農家、宮川家の出身で幼名は宮川勝五郎。当初は島崎勝太（しまざき かつた）の名前で登場した。誠意の塊のような人物で、農家の出身故に、人一倍武士らしくありたいと思い、卑怯なことや道理に合わないことを好まない。それ故自分のためとはいえ辣腕をふるう土方を度々窘める一幕もあった。げんこつを丸ごと口に咥えこむという珍妙な特技を持つ。新選組と改めてからは、総髪になる。
天然理心流宗家・近藤周助の門下に入り、後に養子となり宗家4代目を襲名しながらも、時代が動き出していることを感じ自分の生き方を悩み続けていた。浪士組が募集されると、門弟である土方、沖田、山南、井上、永倉、藤堂、原田らと共に上洛する。そこで芹沢など様々な武人達との交流を隔てながら、時に苦渋を飲んだり、苦悩したりしながらも真の武士になる為に歩み続ける。清河との決別を経て壬生浪士組を結成し、芹沢、新見と共に局長に就任。隊を纏めていくことになるも、芹沢達の乱暴狼藉に手を焼く。土方達が粛清を決断した後も芹沢暗殺に踏み切れなかったが、やがて覚悟を決めた芹沢本人からの「鬼になって俺(芹沢)を食っちまえよ！」との言葉で暗殺に同意する。その後は京都守護職・松平容保のもと、新選組の局長として、内山彦次郎らを排斥しつつ京の治安維持や長州による政変などで活躍し、晴れて幕臣となる。
しかし政治状況は激変し、次第に幕府そして新選組は衰退の道を辿ることになる。隊では山南の脱走やその後の切腹、そして伊東や藤堂ら御陵衛士の分裂など様々な悲しい別離や苦難に当たる。それでもその真っ直ぐな志でぶつかり来る苦難を受け止め、一度は袂を分かった伊東とも和解するも、その矢先に先走り過ぎた若手隊士達の独断によって伊東が暗殺され、それをきっかけに御陵衛士との全面闘争へと発展した末、藤堂も戦死するという悲しい結果となった。後日、御陵衛士の生き残りによって近藤は銃撃され、治療のために大坂城へ行くが、その間に起きた鳥羽・伏見の戦いでは近藤達の兄的存在であった井上が戦死。次第に劣勢となる中、幕府軍艦で江戸へ引き揚げた後も徳川のために官軍と戦おうと画策したが、時勢はそれを許さなかった。勝海舟の要請によって甲陽鎮撫隊を率いて甲府城を目指すも、東山道を降ってきた新政府軍に敗れ、それが原因となり永倉、原田が離隊。その後大久保大和の変名を用い、武州五兵衛新田にて再起を図る。新たに隊士を集め、会津藩に合流するべく下総流山で隊士の調練を行っていた最中に新政府軍に包囲され、周平を離隊させ、さらに新選組を土方に託すと、単身新政府軍の陣地に連行される。土方に最後「トシ、もう疲れたよ」といった。養母ふでの励ましを皮切りに「お前は多摩の誇りぞ！」と周囲からの労いの声援を受け、「トシ」と呟いた直後、斬首の刃が振り下ろされた所で物語は終わる。
土方歳三（ひじかた としぞう）
演：山本耕史
副長。多摩の出身。近藤とは幼なじみで「かっちゃん」「トシ」と呼び合う無二の親友。極度の女好きで、それだけに伴侶を一人に選ぶつもりもない考えから、結婚を考えていない。多摩でも、周りが進めていたお琴との見合いをふいにし、不興を買っている。秀二郎がひでの男装であったのを見抜けず、相当悔しがっていたこともある。成長しつつも所々で逡巡する近藤と比べると、必要ならば謀略や暗殺も行う決断力に富んだ切れ者であり、また作戦立案や組織造りなどに抜群の才を発揮する知恵者だが、その知恵と洞察力から、仲間の不正を暴いてしまい、その不正が正義や人道の理由であっても切腹をさせてしまうなど、罪悪感から自身を苦しめることもある。普段は自分を律しているが近藤を「近藤さん」と公共の場では呼びながらも、感極まる出来事を体験した際には「かっちゃん」と呼び、自分に都合の悪い話をする際には目を違う所に向ける癖があるなど大人になれない部分もある。
一時は行商の道を志し家伝の石田散薬の行商をしていたりしたが、剣の道を志し天然理心流に入門する。一時は「剣は総司がいる。頭（知恵）は山南がついている」と考え、自分は近藤には必要ないのではないかと自信喪失するが、周斎に「山南の知恵は書物で学んだ知恵だ。お前の知恵は生きた知恵だ」と諭される。京に上ると近藤を大名にすることを狙うが、「八月十八日の政変」で自分たちが時勢の蚊帳の外にいることを痛感、近藤を日本一の侍にするために鬼になることを誓った。その後、芹沢暗殺を決意して山南・原田・井上（後に沖田も加入）、そして（この時、消極的だった）近藤を交えた芹沢暗殺計画を実行。斎藤の妨害に遭いつつも、芹沢の覚悟を汲み取って鬼となった近藤から「お前に浪士組の行く末託した」と告げられたことで自身も近藤の決意を受け止め、激闘の末に計画を成し遂げる。以後、近藤のために嫌われ役に徹し組織統制に辣腕をふるい多くの隊士を粛清したことから「鬼の副長」の異名で呼ばれるようになる。一方で山南や河合らを不本意ながら切腹させないといけなくなった場合や、自分達の意に反して藤堂を討ち死にさせてしまった際には人知れず涙を流した。江戸に帰った後は洋装になり、関東敗走後は内藤隼人の変名を使用。流山で近藤と訣別した後も宇都宮、会津、函館と新政府軍を相手に死場所を求めて戦い続ける。
2015年下期の連続テレビ小説『あさが来た』でも、山本は土方役として本作と同じ衣装・同じセリフで出演した[9]。
沖田総司（おきた そうじ）
（沖田惣次郎→沖田総司）
演：藤原竜也（少年時代：田辺季正）
副長助勤・一番組長。幼名は惣次郎（そうじろう）。試衛館の中でも最も剣の才能に恵まれ、若くして塾頭になり近藤をして「宗家5代目を襲名させたい」と言わしめる。無邪気で天真爛漫な性格だが、仲間内で一人前の大人として扱われないことに不満を持っていた。また剣に自信を持っているため最初に山南と試合して敗れた際には多少の引け目を感じていた。
上洛後は芹沢やお梅に魅せられて一時行動を共にしていた。それ故に「芹沢さんは自分が斬らねばならない」と理解し、芹沢暗殺事件では参加を志願。その後も池田屋事件などで活躍。肺結核を患い医者には静養を勧められるが、剣への情熱と責任感からかえって稽古や任務に熱を入れるようになり剣の鬼と化していく[10]。病気を隠していたもののある時、遂に皆の前で大量の血を吐いて昏倒して以降は療養生活となり、戦列を離れお孝の看病を受ける事になった。新選組が伏見に移転した時も京に残ったが、そこを浪士らに襲われる。しかし、お孝の機転で難を逃れ、銃撃され負傷した近藤と共に大坂城へ送られ松本良順の治療を受ける。江戸に戻った後は、病を圧して甲陽鎮撫隊に加わり多摩へ向かう。しかし、多摩で土方と剣術を立ち会っている時に倒れ、近藤に江戸に戻るように命じられる。植木屋平五郎宅で療養していたが襲撃される。その際、お孝を斬られ、襲撃してきた刺客を返り討ちにするが再度吐血し昏倒してしまう。本編ではその後に関する描写はなくナレーションで近藤の死を知らされぬまま病死したと語られるのみであり、総集編では姉のみつが「勇さんの後を追うように亡くなった」と語った（史実でも総司は近藤が斬首された約1か月後に病没している）。
悲劇の天才剣士と呼ばれる。
斎藤一（さいとう はじめ）
（山口一→斎藤一）
演：オダギリジョー
副長助勤・三番組長。剣の流派は不明だが隊中きっての達人で沖田と双璧をなす。無口かつ冷徹で自分から人と交わろうとすることはほぼ皆無だが、仲間を想う心を内に秘めており、徐々にそれを表に出す事が多くなっていく。また義理に厚く受けた恩を決して忘れない性格だが、そのことが災いして厄介な事態を惹き起こすこともある。坂本龍馬に岡田以蔵とどことなく似ていると言われた。よく短刀で彫刻を作っている。
最初は山口（やまぐち）一を名乗り、江戸で借金取りをしていた。近藤とは広岡子之次郎の借金を取り立てに来た時に出会う。人を斬って追っ手に追われている時、近藤の祝言が行われている近藤家に転がり込み匿われ、後に近藤の依頼を受けた芹沢の手引きで逃亡した。後に京の地で芹沢達が清河八郎を斬ろうとしている時に近藤たちの意を理解して清河を逃し、そのまま壬生浪士組に入隊する。芹沢暗殺の際には江戸の件で恩を忘れられず襲撃に向かう土方、沖田、山南、原田を阻止しようとするが、同じく義理のある近藤の仲裁により道を空ける。近藤や土方の依頼で暗殺や、複数の隊士の介錯を務めたことが多いが、夜魘される事もあった。伊東達が御陵衛士を結成した時には、間者として潜り込む。鳥羽・伏見の戦いで井上源三郎が戦死した時には激昂し、凄まじい怒声を上げながら狂ったように敵陣へ単独で斬り込んだ。甲陽鎮撫隊の敗戦後、隊を離れた永倉たちを「間違っている」と言い「この旗がある限り新選組は終わらない」と皆の前で隊旗を掲げて叫ぶ。
『最期の一日』では処刑された近藤の首級を彼が奪還し会津に持ち帰り土方、松平容保とともに弔ったとされている（ただし素性が分かると、近藤や新選組を恨む新政府軍の面々に墓荒らしにあうことを土方が懸念したため俗名は明記せず）。その際函館へ転戦する土方の代わりに近藤の首級と容保を護衛するべく会津に留まる。
なお、本編の最終回では容保から近藤の首級を奪回するよう密命を受け、その際に本物の虎徹を下賜されている。
藤堂平助（とうどう へいすけ）
演：中村勘太郎
副長助勤・八番組長。北辰一刀流伊東道場で学んでいたが、試衛館に入門する。誰に対しても礼儀正しく、とても穏やかで良識的な性格の反面、稽古は厳しく戦闘になると人が変わったように激情的な剣を振るう。天才剣士の沖田には常に引け目を感じていた。
一時は沖田になりすまして京の町で遊んでいたが近藤に諭される。池田屋事件では一番乗りの大役を果たし奮戦するも、汗を拭おうとした隙を衝かれ重傷を負い、額に傷が残ることになる。一時期江戸に帰還し近藤らとともに幕府へ長州征伐の談判を行う。主要人物の中では唯一山南の切腹に立ち会っておらず、京に帰還後に知らされた。後に師の伊東甲子太郎一派が入隊すると、試衛館の仲間達との間で葛藤する。御陵衛士に加わった後も伊東と近藤らの板挟みとなる。油小路の変では義を貫き御陵衛士として奮戦。永倉や原田たちは藤堂を助けようとするが、永倉の様子からその思惑を知りながらも逃げるばかりか、より一層激しい表情を浮かべて戦い続け、事情を知らない新選組隊士に背中を斬られる。そして駆けつけてきた近藤から「お前は、真の武士だ」と称賛され、皆の見守る中で穏やかな表情を浮かべながら息を引き取る。
原田左之助（はらだ さのすけ）
演：山本太郎
副長助勤・十番組長。伊予松山の出身。大坂谷道場で種田宝蔵院流を学んだ槍の名人で、鍵槍を愛用して数多くの修羅場で活躍する。底抜けに明るい三枚目で、近藤一派のムードメーカー的存在。かつて切腹しようとした時の傷があり、何かにつけてその傷を自慢したがる。常に何かを食べており、よく寝転がっている。
当ての無い旅の途中、滝本繁蔵の屋敷の護衛を頼まれた近藤たちと出会う。天然理心流4代目襲名の際の紅白試合に勝手に加わり、そのまま試衛館の食客となり、近藤らとともに浪士組に参加する。上述のようにお調子者的な面が目立つが、亡き夫と瓜二つということで可愛がられた八木久の死に対しては涙を見せ、落ち込んでしまう。さらに芹沢暗殺事件の際は敵に情けをかけて逆に斬られそうになった山南を助け「戦じゃなぁ、躊躇った方が負けなんだよ。先生」と諭すなど、実戦家としての面も見せた。甘味屋のまさに何度も思いを伝えては何度も断られるも、禁門の変で燃える京の町から彼女を助け出したことにより二人は結ばれる。甲陽鎮撫隊の敗戦後、永倉と共に隊を離れ、江戸で同志を集めようとしていた所、永倉が旧友と再会し、靖兵隊への参加を持ち掛けられるも旧友との縁から永倉が承諾したのに対し、「別の隊に加わるつもりはない」と拒否。永倉とは笑顔で分かれ、妻のいる京に戻ろうとする。近藤が板橋の刑場に引き立てられた際に現れ、「尽忠報国の士天晴れなり！新選組は不滅だ!!」と、涙ながらに熱いエールを送り、近くのお地蔵様に供えられていた菓子を食いながら「俺も不滅だ！」と言い、颯爽とどこかに駆け去っていった。上野戦争で戦死したとも、馬賊になったとも言われると最終回で説明されており、本編でもまさから「薩長の世の中になったらどうする」と聞かれた際、「大陸に渡って馬賊になる」と言っている。
山南敬助（やまなみ けいすけ）
演：堺雅人
副長、のち総長。仙台の浪人で北辰一刀流の門人であったが、同門の坂本龍馬から「（近藤勇は）面白い人物だ」と紹介されて興味を持ったのがきっかけで試衛館を訪れ、近藤の人柄に惹かれ門人となる。常に笑顔を絶やさず、何を口にするにも丁寧な口調で話す品のある人物。北辰一刀流免許皆伝で、最初に試合をした時には沖田を破り、直後の近藤との試合では「負けてみないと強さが分からない」と敢えて隙を作り近藤に勝たせる余裕を見せる程であった。その際、「彼（総司）はよい資質を持っている。必要なのは経験」と述べており、数年後には沖田に負かされている。学問にも明るく時勢を見極めていて、近藤を知の面から支える。
勇を浪士組の創設者・清河八郎、浪士組取締役・山岡鉄太郎と引き合わせ、浪士組への参加へのきっかけを作る。また、京で清河の浪士組から離れた時に会津藩の預りとするよう近藤に進言する。当初は副長を務めたが、土方により総長に棚上げされる。また、誠実で人斬りを望まない性分の為か芹沢暗殺事件では、土方を補佐し、平間を退けるが続く平山を斬ることができず、逆に斬られそうになったところを原田に救われる一幕もあった。そのため以後は、前線での戦闘には参加しなくなり、池田屋でも屯所に残留していた。
お互い認め合いながらも、度々土方とは対立し、屯所の本願寺移転でも反対するなど、論争は絶えなかった。その後、伊東らの入隊で、ますます自らの居所をなくしたと感じていく。隊のあり方に疑問を感じていた最中に起きた、永倉らの建白書提出に端を発する土方の処分をきっかけに、明里を伴って脱走したが、脱走と言っても身を隠したり先を急ぐことをせず（ただし明里に草津までは急ぐよう促す描写もあったが、結局は彼女のお転婆に振り回される形で足止めをくらってしまった）、まるで明里と連れ立って旅をするのも同然だった。馬で追いかけてきた沖田に近江の草津で見つかり、自ら声をかけて京に戻る。沖田は山南を逃がそうとしたが、その甲斐なく終わってしまった。そして、その死を惜しむ周囲の皆に事あるごとに再度の脱走を促されるが全て謝絶する。そして死別の言葉を残して志を託し、近藤、土方ら試衛館の仲間たちが見守る中、隊のために団結を願い、沖田の介錯のもと切腹。主要人物9人の中で最初の死者となった。
永倉新八（ながくら しんぱち）
演：山口智充
副長助勤・二番組長。神道無念流免許皆伝の達人。近藤や土方より年下だが容姿・言動共に老成しており、初対面の際に2人を驚かせる。筋が通っていない事や曲がった事を嫌う正義漢。左之助とはウマが合いよく一緒に行動している。
近藤とは滝本繁蔵の屋敷の護衛を頼まれた時に出会う。その後ヒュースケンを襲撃しようという賊の1人として再会するが、勇の必死の説得で思い留まり、勇達の側に寝返って賊を返り討ちにした。これがきっかけで勇の勧めもあって試衛館の食客になり、浪士組の一員として京へ赴く事になる。近藤の裏表の無い人柄に惚れ込んでいるがそれ故に「自分達は近藤勇の同志であって家来ではない」という意識が強い。そのため池田屋事件での報奨金分配や局長の権力を強める組織の命令系統の案に異を唱え、土方が口を滑らせて芹沢暗殺を暴露した事も追い打ちとなり（内部での争いを断固として認めないため、永倉は芹沢の暗殺を聞かされていなかった）、松平容保に建白書を提出するなど、しばしば近藤、土方の路線とは対立することもあった。
甲陽鎮撫隊の敗戦後、会津に行くことを近藤に提案するも受け入れられず、自分に従うよう命令する近藤に怒りを抱き左之助とともに隊を離れた。その後、左之助と共に江戸で同志を募る算段を考えていた所、旧友である市川宇八郎と再会し、縁から彼が立ち上げた靖兵隊に加わることを決める。近藤と決別こそしたものの、近藤の同志であるという思いは最後まで揺るがず、宇八郎が近藤を貶す発言をすると彼を強く叱責した。
井上源三郎（いのうえ げんざぶろう）
演：小林隆
副長助勤・六番組長（最初の隊内編成の際に土方から、副長に推挙されるが辞退している）。通称「源さん」。多摩出身で周助の代に試衛館の門人となった勇の兄弟子。温和な人物で常に勇や土方、沖田そして勇の養子周平などを見守っている、いわば父親的な存在である。新選組では最年長。
浪士組の結成の際には周斎から勇の「お目付役」として共に京へ上るよう頼まれる。新選組では地味ではあるものの組織の潤滑油として欠かせぬ存在となる。なお、劇中では一番長い刀を使っている。最後まで勇を支えた。鳥羽・伏見の戦いで周平を庇い新政府軍に奮戦するが、1度は正面からの一斉射撃を奇跡的にやり過ごすものの、周平に向かって振り向いた直後に背後からの銃弾を受け倒れる。その死は隊士達に衝撃を与え、土方は人目を憚らず号泣し、斎藤に至っては激昂し、凄まじい怒声と共に敵陣に突撃をかけた。死後幻影として療養中の勇の前に出現し、死してもなお勇の身を案じ続けていた。勇はその幻影が意味するものを察し、お目付役として共に上京した源三郎に「ここまで付き合わせてしまって悪かった」と述べそっと目を伏せ涙した。
水戸派（精忠浪士組）
芹沢鴨（せりざわ かも）
演：佐藤浩市
筆頭局長。水戸天狗党の出身で、同郷の新見や粕谷とは付き合いが長い。剣術・学問の実力を備えた一廉の人物で、プライドが高く傍若無人な面が目立つが、自分も他人も心から信じることが出来ず、自身の弱い部分を突かれると己を律しきれなくなる哀しい男でもある。酒癖が悪い。
近藤とは広岡子之次郎の稽古代の催促に来た時、山口（斎藤）一と共に料理屋の主人として出会う。水戸藩出身のため、桜田門外の変に参加する広岡を逃す。その際、近藤、山口に鯉のあらいを振る舞いながら「明日天地がひっくり返るような大事件が起きる」と語る。そして事件が起きた後、桜田門外に現れ酒を飲みながら「尽忠報国の士、天晴れなり」と叫ぶ。
その後、浪士組に参加。新見と共に三番組の小頭となる。先番宿割の役を与えられた近藤が本庄宿で芹沢が仲間と騒ぐので一人部屋を用意するよう佐々木に命じられ、宿の離れを用意されるが、鶏小屋であったため激怒、町の真ん中で焚き火をしながら野宿をし、周辺から燃やすものを仲間に集めさせ、浪士組の面々のみならず、巷の人々も困惑させた。しかし、近藤に根負けして焚き火を消すように命じた。このことで近藤に強い興味を持ち、その後浪士組が江戸に戻った後も京へ残留。近藤達と壬生浪士組（水戸派は精忠浪士組と名乗っていた）を結成。局長となる。
京では粗暴でやりたい放題な日々を送るが、その一方で自分とは違う真っ直ぐな生き方でありながら、自分に敬意を持って接してくる近藤に次第に引け目を感じるようになる。また、沖田に対しても自分の一派に加えるなど彼なりに一目置く。そんな破滅的ながらも、どこか哀愁を感じさせる生き様は沖田やお梅も魅せられた。自分が大坂相撲の力士達と起こした「どっこい事件」を近藤が実直な対応で解決に導いた事で、近藤に対するコンプレックスを更に募らせ、遂には商家の大和屋を襲うなど乱暴狼藉をエスカレートさせてしまう。
その結果、会津藩から見切りをつけられた事で、土方や山南は芹沢一派の排除を決意するが、近藤だけは芹沢への敬意や、その士道に背くような非情なやり方への抵抗感からなかなか決意できずにいた。一方、芹沢自身も新見の切腹による一件で自分が近く浪士組より排除される事を察するが、それを受け入れるかのように、粛清当日である「八月十八日の政変」の褒美を貰った祝宴の席で泥酔しながらも、自分を粛清する事に未だ決断を下せずにいる近藤に対して、「鬼になれよ。鬼になって俺を食っちまえよ。遠慮はいらねえよ」と自分の覚悟を告げつつ、容保から貰った「新選組」と書かれた文を見て「明日からこの名前で行けよ」と、自ら近藤の背中を押して、その決意を後押しした。
その後、土方、山南、原田、沖田は芹沢一派（粛清対象から外された野口以外）が八木邸に戻る道中を襲う予定であったが、斎藤の妨害に遭った事で予定がズレて、八木邸に戻り皆が寝静まった頃を見計らって芹沢の寝床に突入する。芹沢は白装束に着替え、酒を飲みながら座って待ち構えており、激戦の末、愛用の酒の入った瓢箪に足を取られた事で最後は沖田に刀を突かれ、土方にとどめを刺される。沖田は本来この襲撃には加担しない筈だったが、土方の態度から事情を察した沖田本人が刺客役に加わる事を希望し、芹沢も刺客達の中に沖田がいる事を確認した際に「嬉しいぜ」と零したり、沖田に刺された際にはどこか満足気な笑みを浮かべるなど、はじめから沖田の刃に倒れる事を望んでいたかのような節を見せた。死後この一件は土方によって長州藩士の仕業に偽装された。
近藤達が越えなければならない壁とされ、ドラマの前半を支える重要な役柄となっている。佐藤と脚本の三谷幸喜は「大河ドラマ史上最高の悪役」を狙ったという。また、佐藤の父である三國連太郎も1969年に公開された三船敏郎製作・主演の映画『新撰組』において、芹沢を演じており、親子二代で同じ役を演じた事で話題となった。
新見錦（にいみ にしき）
演：相島一之
局長、のち副長。芹沢の右腕的存在。学があるため、浪士組の上京後の清河八郎の朝廷への建白書の真意をつかみ、佐々木只三郎へ報告する。芹沢を理解し行動を共にしており、次第に組織内で顔が大きくなっていく近藤達を懸念して、芹沢と水戸派の地位を守る為に牽制を図るなど、試衛館派（特に土方・山南）に対して度々角を立てていた。
商家の大和屋の一件で芹沢から責任を押し付けられ、副長に降格、謹慎の処分を下される（その際に芹沢からは「腹を切れ」とまで言い渡されるが、その場では近藤達のとりなしで降格・謹慎で済まされた）。自身をぞんざいに扱ったことに不満を感じていたところを水戸派一掃を狙う土方と山南に突かれ、芹沢が又三郎を斬殺した顛末を報告して芹沢を売るように仕向けられる。同時に隊内を律するための局中法度が設けられたが、これは新見を体よく葬るためのものでもあり、土方・山南の策謀によって逆に仲間を陥れようとした「士道に背いた」罪で詰め腹を切らされ（芹沢の又三郎斬殺の一件に関しては法度制定の前の事であった為、不問とされた）、土方が渡した刀で切腹し、局中法度によって粛清された最初の犠牲者となった。その際、その後の新選組の行く末を予感させる恨み節を残している[11]。亡骸は、島田・松原によって運び出され葬られる事となった。
平山五郎（ひらやま ごろう）
演：坂田聡
副長助勤。史実では、新見の失脚後に局長に昇進したとされているが、本作では階級の昇降は見られない。左目に眼帯をしている。武芸の腕前だけなら新見以上の実力者である水戸派の中でも屈指の武闘派だが、反面、思慮が浅く、粗暴で軽挙な面が目立つ。近藤に無礼を働いたため、壬生狂言が八木家で行われた時外に出て斎藤に打擲される。また男装していた八木家の娘ひでに詰め寄ったために沖田に取り押さえられ、後の相撲大会では沖田と斎藤に完全に萎縮していた。芹沢暗殺の際には山南が平間と同様に逃がそうとしたが、平山は背後から山南に斬り掛かり、とっさに原田が投げた槍によって死亡した。
平間重助（ひらま じゅうすけ）
演：剛州
副長助勤。初期では隊内の勘定を任されており、同じく頭脳派である新見の補佐役として試衛館派への牽制などを行っていた。芹沢と行動を共にしていたが、芹沢暗殺の際には山南に逃がされ、そのまま何処かへと出奔した。
野口健司（のぐち けんじ）
演：岡本幸作
副長助勤。芹沢派の中では年若く、年齢の近い沖田や藤堂と親しかった。性格はやや好戦的な一面もあるが、芹沢派の中では比較的穏やかで、芹沢達の暴挙には無理矢理加担させられていたに等しかった為、芹沢の暗殺時には角屋に引き止められる形で粛清の対象から外された。水戸派が壊滅したのち史実では隊に残り、最終的には切腹することになるが、今作では水戸に帰郷するよう近藤や藤堂から勧められる描写があり、その場面を最後に姿を消す。
佐伯又三郎（さえき またさぶろう）
（又三郎→佐伯又三郎）
演：松谷賢示（水玉れっぷう隊）
副長助勤。元は八木家の奉公人であったが、本物の武士になるために京に残った浪士組に入隊、芹沢一派（水戸派）の腰巾着になる。本人は水戸派についた理由を「どうせ取り入るなら偉い奴の方がいい」と語っていたが、その芹沢本人からは「町人上がり」と忌み嫌われ、新見ら他の水戸派の者達からも然程相手にされていなかった。唯一同じく（一時的に）水戸派に属していた沖田とはそれなりに仲が良かった。かつての主である源之丞を含む町人達には傲慢な振る舞いを見せる一方、芹沢には常に胡麻を擂り続け、取り入ろうとするなど、一見すれば小物な人間であるが、その一方で武士への憧れの気持ちは本物であり、刀を買う為に八木家の奉公人時代から金を貯め続けていたり、芹沢からどれだけぞんざいに扱われようとも「このくらいの苦労は覚悟の上」と語るなど、努力家な一面もある。また、浪士組で羽織を考案する事になった際には京の市井の人々の意見を踏まえた上で近藤達に忠言するなど、稀に良識的な部分を覗かせる事もある。
ある晩、飲み屋に案内する途中でうっかり足を滑らせたはずみに持っていた提灯を芹沢にぶつけてしまった為に芹沢の怒りを買ってしまい、斬殺される。直前に彼から武士になる夢を聞かされていた沖田は悲壮に想う一方、斎藤は「取り入る相手を間違えた」と冷淡に一蹴した。
貯めていた金の入った財布は物盗りの犯行に見せるため新見に抜き取られるが、それが皮肉にも新見の命取りにつながった。
御陵衛士となった隊士（伊東道場一派）
伊東甲子太郎（いとう かしたろう）
（伊東大蔵→伊東甲子太郎）
演：谷原章介
参謀。当初の名は大蔵（おおくら）。文武に優れた品のある人物で、怜悧に時勢を見極め外国の知識にも精通しているが、それ故に人を見下す傾向が強い。神道無念流を学んでいたが、江戸に出て北辰一刀流剣術伊東道場に入門し、後に道場を継いだ。門下に藤堂平助がいた。ただし、彼らには試衛館派の土方や芹沢派の新見のような右腕的な補佐役は存在せず、加納、篠原が実質その役割を担った。浪士組には参加しなかったが、挨拶に来た藤堂に餞別を渡し、浪士組とのつながりを持とうとする。
江戸に隊士の募集に戻った近藤に対面し、新選組に入隊し参謀となり名を甲子太郎と改める。しかし、伊東の真意は新選組を尊王攘夷の先駆けとすることであった。その後、「薩長への偵察」との名目で脱隊を図るが、近藤や土方は伊東の本心を見抜きつつもかつての芹沢一派のような流血の事態を避けようと、表面上は騙されたふりをして伊東たちを送り出した。そして御陵衛士を結成するも、討幕派からは新選組にいた過去から信頼を得られず苦悶する。大久保一蔵にかつて新選組にいた過去をぬぐい去るために近藤を斬るよう唆され、近藤の別宅に招かれ伊東はその場で勇を殺害するつもりだったが、近藤から「あなたが弾かれるのは新選組にいたからではなく、彼らのように薩長の生まれではないからだ」と言われ、腹を割って心中を吐露し、自身も近藤から「私も生まれ故に幕府の武士から見下された。だからこそ新選組では生まれよりも士道を重んじた」との主張を聞く事で、互いに追い求める思想は違えども、国を想う気持ちは同じであった事に気が付き、和解する。
しかしその帰路で、事情を知らずに伊東を討ち取ろうと待ち構えていた大石鍬次郎率いる新選組の若手隊士達に襲撃され、近藤の想いを無下にするような彼らの軽率な行動を一喝しつつも、抗争を避けるべくあえて抵抗しようとせずに場を離れようとしたが、その隙を突かれる形で大石によって槍で刺殺されてしまう。その後、御陵衛士側に先立って事態を知った近藤は和解した矢先の伊東の死に愕然としつつも、これにより御陵衛士との抗争が避けられぬものとなってしまったことを悟った土方達に促され、やむなく彼らと刃を交えるという苦渋の決断を下した。
伊東の遺体は、土方の判断で七条油小路に放置され、彼の死を知った御陵衛士の隊士達はこれが罠だと気付くが、「たとえ罠でも、伊東先生の亡骸を晒し者にするわけにはいかない」という理由で現場へ行き、待ちかまえていた新選組との間でついに全面衝突が勃発。藤堂平助をはじめ両陣営に多くの犠牲を出すこととなる。
加納鷲雄（かのう わしお）
演：小原雅人
過激な言動の多い伊東一派にあっては温厚な人物で、仲間を諭したり外交役としての出番が多かった。藤堂平助が伊東大蔵に試衛館への移籍を願い出た際、永倉の提案で沖田と加納が立ち会い沖田が勝てば移籍を認めるという条件で立ち会うが敗れた。そして、「藤堂を譲る代わりに沖田が欲しい」という伊東を諫める。結果伊東は「（試衛館に）しばらくの間貸し付ける」と言いつつも、藤堂の移籍を認めた。沖田には敗れたものの剣術の心得が全く無いわけではなく、油小路の変では永倉と互角に渡り合っている。後に伊東と共に新選組に入隊する。御陵衛士として分派する時に土方とこれ以上隊士が加わることを禁止するとともに、御陵衛士から新選組に復帰することを禁止する取り決めを行った。油小路の変では篠原と共に御陵衛士を主導する。
事件後、復讐のために伏見街道で篠原らとともに近藤を狙撃する。しかし、闇討ちのようなやり方には若干躊躇していた。その後官軍に属して、流山で大久保大和と主張し尋問に行き詰まっていた香川、上田の命により近藤と再会する。そして旧交と任務の板挟みとなった彼に近藤は自ら「加納君、お久しぶりです」と語りかけ、加納もそんな近藤の心遣いを察しながら「ご無沙汰しております、局長」と返した。
篠原泰之進（しのはら たいのしん）
演：小梶直人
伊東一派でも特に好戦的な人物で、自身の主張を強引に押し通そうとする傾向があり、よく加納に諭されている。剣の腕前も確かで、不意を突かれたにもかかわらず斎藤、永倉と互角に渡り合った。長州藩との交渉に臨むべく広島に向かった近藤、伊東に同道する。御陵衛士に参加し、間者として潜り込んだ斎藤一が新選組に戻ろうとした際、斬り合いとなる。油小路の変では加納と共に御陵衛士を主導し、変後、復讐のために伏見街道で近藤を狙撃する。その際、「これでは闇討ちだ」と指摘する加納に対し、「構わん。奴ら(新選組)も散々汚い手を使ってきたではないか」と吐き捨てた。
服部武雄（はっとり たけお）
演：梶浦昭生
伊東と行動を共にする伊東一派随一の武闘派。間者として潜り込んだ斎藤一が新選組に戻ろうとした際、斬り合いになった篠原に加勢する。しかし、永倉たちが斎藤の応援に駆けつけたため、斎藤は難を逃れる。油小路の変では二刀流で奮戦するも敢え無く戦死する。
毛内有之助（もうない ありのすけ）
演：中川泰幸/現・中川邦史朗
油小路で戦死。
三木三郎（みき さぶろう）
演：平泉陽太
九番組長（第46回にて10番組編成の名簿に名前あり）。史実では伊東の実弟だがドラマ内では言及なし。間者として潜り込んだ斎藤一が新選組に戻ろうとした際、斎藤一と斬り合いになった篠原に加勢する。油小路の変より撤退した後、仲間と共に病身の沖田を襲撃するがお孝の機転によって未遂に終わる。
中西昇（なかにし のぼる）
演：猪狩賢二
伊東と行動を共にする。伊東一派が新選組を離れた後は登場しない。
その他の新選組隊士
前述の3つの派閥に属さない隊士達。なお、土方は第20回で行われた隊士募集で、採用された隊士（河合・松原等）は後々近藤派に属する事になると語っているが、実際は谷兄弟や大石など、近藤、土方の思惑に反して、各自勝手に行動する者も少なくない。また、武田はどの陣営にも中立である事を逆手にとって、近藤と伊東派の融和を試みた事もあるが、失敗している。
島田魁（しまだ かい）
演：照英
諸士調役兼監察。美濃出身の浪人で、旧知の永倉の推薦で入隊した。怪力の巨漢で、戊辰戦争では完全武装した永倉を片手一本で塀の上につり上げる場面が見られた。強面に似合わず人情家で、涙もろい感激家。人懐っこい性格であり、養子縁組を頼まれては断れず何度も姓が変わっている（なお、出生時の姓は「近藤」だった）。権力や地位にも全く固執せず、新選組が直参に引き立てられても当人の希望により平隊士であり続けた。普段は監察方として偵察や見張りに従事している。粛清に関わる事もある。ひとたび戦が始まると重い鎖帷子を全身にまとい大暴れする。正月には屯所のある西本願寺を訪れた子供達といっしょに遊ぶ姿も見られた。また、相撲大会に参加してふんどしが切れ、不浄負けするという一幕もあった。
『新選組!! 土方歳三 最期の一日』でも新選組の頭取として活躍するが、土方の死を知り号泣し、永井尚志に諭され、新選組を後世に語り継ぐことに誓った。晩年は西本願寺の警備を務めたと最終回で説明されている。
武田観柳斎（たけだ かんりゅうさい）
演：八嶋智人
副長助勤・五番組長。出雲国母里の出身で甲州流軍学を学んでいた。常に眼鏡をかけている。体躯にも恵まれぬゆえ学問や参謀で身を立てようと、浪士組が新選組と名を改めてからの隊士募集で入隊。剣技には秀でていないものの池田屋事件では、宮部一派の拠点の襲撃を提案し、戦闘では近藤隊に属して参加した。軍師として池田屋事件をはじめ数々の局面で近藤を支え続けるも、自信過剰な性格で人望に薄い、しかし近藤をはじめ、新選組の為に頑張っている武田の努力を認めている人間も少なくなく、武田を快く思っていなかった土方でさえも、新選組に対する思いを聞いたときは否定しなかった。何かと自分の手柄を強調することが多く、「軍師ですから」「私が〜」が口癖である。
甲州流軍学が時代に遅れつつあることを感じ取り、最先端の西洋軍学を学ぼうと隊費を管理していた河合から50両借りたが[12]、そのことが河合耆三郎切腹の原因となってしまう。これで評判を落とした武田は、直参取り立ての際に兵学師範であるということから他の副長助勤より格上の見廻組肝煎格への内示を受けるが、永倉、原田からは日頃の行いが悪く河合を切腹させた原因として不満だと異論が出た。そのため他の副長助勤と同格で納得するよう近藤に説得されるが、激怒して直参取り立てそのものを返上する。そして直参取り立てに不満な茨木、佐野、中村、富川らを御陵衛士へ参加するよう勧め、武田は話をつけに御陵衛士の元へ向かうが加納に参加を断られて立場の悪くなった四人が切腹してしまい、その事で新選組の隊士に尚更疎まれて居づらくなり、出奔。西洋軍学書を手土産に御陵衛士に参加しようとするが、伊東は既に西洋軍学書を手に入れており、しまいには「西洋軍学書を横取りして邪魔をした人間」として裏目に出てしまい伊東にはすげなく断られる。薩摩藩に縋ろうとするが、会津の軍事機密を持ってくるように西郷吉之助に言われる。行き場を無くしているところ、土方と沖田に隊に連れ戻される。本人は半ば自棄気味に切腹する覚悟は出来ていると嘯くが、近藤からは切腹を命じられることはなく、「自分のせいで死んだ者達の為にも生きる事で償え」「もう一度這い上がって来い」と諭され生き続けることを命じられる。改心して平隊士からやり直す決意をしたが、自分が恨みを買っていると自覚しているがゆえに、嫌がらせ[13]をされぬよう相部屋ではなく個室を所望した。しかしその直後、屯所を抜け出して河合の墓参に行ったのを沖田に見つかり、事情を話したことで見逃してもらうが、そのすぐ後に脱走と決めつけて追って来た大石鍬次郎らに背後から急襲され、落命する。
改心した矢先での突然の死に、直前まで話をしていた沖田と信頼していた近藤が武田の死を惜しんだ[14]。
河合耆三郎（かわい きさぶろう）
演：大倉孝二
勘定方。播磨の商家の出身。武術の才は皆無だがそろばんが得意で勘定方として隊の金銭面を支え続けた。愛想のいい人柄で、人の良いところを見つけるのが上手く、多くの人に好かれている。同郷の松原とは特に仲が良い。西洋軍学習得に熱意を燃やす武田観柳斎に兵法書の購入資金を捻出したことから、同じ本を狙っていた土方に勘定帳と隊費の数字が合わないことを詰問される。武田のことは口を割らず、親元から50両届けさせることを条件に勘弁してもらうように願い出て許されるが、親元から10日経っても50両は届かず切腹させられることになる。死への恐怖から、腹を切ろうとはしなかったが、ついに覚悟を決めた折に、介錯の谷三十郎がしくじってしまい血の海でもがいているところを沖田がとどめをさした。先述の切腹の際に往生際の悪さを見せてしまったものの、最後の最後まで武田を恨むことはなかった。親元からの金を届ける飛脚が到着したのは、皮肉にも切腹の直後だった。
山崎烝（やまざき すすむ）
演：桂吉弥
諸士調役兼監察。鍼医師の家の出身。浪士組が新選組と名を改めてからの隊士募集で入隊。三回入隊を志願してその度に断られていたが面接していた土方たちは覚えておらず、その人に覚えられにくい容貌や変装を利用して主に探索役を務める。内山彦次郎の悪事や伊東と倒幕派との密会、脱走を試みる隊士等を密かに探索する。また医術にも明るく、病に冒された沖田の病状を察知し、さらには西洋医学も学び伏見街道で御陵衛士の残党に狙撃された近藤を治療する。鳥羽・伏見の戦いで、土方、斎藤と共に不動村の屯所に戻った後、大坂へ引き揚げる途中に官兵に不意に顔を斬りつけられ重傷を負う。江戸へ向かう船の中で島田、尾関、尾形に看取られてひっそりと息を引き取った。
松原忠司（まつばら ちゅうじ）
演：甲本雅裕
四番組長。角刈りが特徴。剣術に加え関口流柔術の心得もあり、入隊時の立ち合いでは素手で斎藤を取り押さえるほどの腕前を見せる。事あるごとに「えいーやあー!!」と気合の掛け声をあげている。自分が殺した長州藩士の妻・お初を捨助が起こした祇園の火事から救うなどなにかと面倒をみている。しかし、そのことを「士道に背いた」と土方に糾弾され、本気で切腹を決意するほどに思いつめていたところ、「お礼がしたい」とお初に食事に招かれ、油断したところを刺され致命傷を負う。しかし斎藤がお初を殺そうとしたとき最後まで彼女を庇い、斎藤に斬られて絶命する。その後、葛山同様斎藤の夢の中に出現した。
尾関雅次郎（おぜき まさじろう）
演：熊面鯉
力の強さを見込まれ旗持ちを務める隊士。池田屋では屯所の守りについたが論功行賞が行われると、屯所の守備についた隊士は対象外という土方の方針により恩賞はもらえなかった。また永倉の建白書の一件では不本意ながらも永倉らと行動を共にして謹慎させられる。鳥羽・伏見の戦いでは銃弾を受けてもなお旗を振り続ける気迫を見せ、永倉率いる抜刀突撃でも先陣を切った。後に宇都宮、函館の戦いにも参戦している。
尾形俊太郎（おがた しゅんたろう）
演：飯田基祐
副長助勤。土方が十番組編成を提案した際の名簿では、後に採用された際とは異なり彼の名前が九番組長として記されていた。池田屋の論功行賞が行われたときに登場（それ以前にも近藤がつねに一筆啓上する際の回想で姿を見せている）。時勢を冷静に分析出来る人物で、山南の死後仲間達の解説役を担当することが多い。山南の遺言により新撰組の活動を詳細に記録していた。近藤の江戸帰還に同行する。近藤が流山で捕らえられたのを機に新選組に再起の道はないと隊を離脱した。新選組そのものともいうべき近藤の行く末を見届けるべく板橋の刑場に出向くがそこで（近藤を救出すべく殴りこみをかけてきた）原田左之助とばったり再会、その後、官軍兵に見つかったため2人して逃亡する。
浅野薫（あさの かおる）
演：中村俊太
諸士調役兼監察。大した実力も度胸も無いのに、功名心と自尊心だけは人一倍強い。池田屋の時には島田魁と共に見張りを担当するが、志願し近藤勇の隊に属する。しかし、斬り合いに怯えて茂みに身を隠す。論功行賞では、さしたる働きが無いまま近藤隊に所属しただけで恩賞をもらっており、一部始終を見ていた永倉が不満を抱く一因になっている。隊内部で繰り返される隊士粛清に身の危険を募らせていき、組長の一人である谷三十郎の粛清に関わったことが脱走を決める決定打となる。近藤周平をそそのかして脱走を図り、斎藤に追い詰められるが見逃され、そのまま何処かへと姿を消した。
谷三十郎（たに さんじゅうろう）
演：まいど豊
七番組長。谷三兄弟の長兄。土方があからさまに嫌悪するほどの甲高い笑い声が特徴。良家の出で槍術を学んでおり、新選組では槍術師範を受け持つ。浪士組が新選組と名を改めてから三兄弟揃って入隊した。弟である周平を近藤家の養子に出すことを近藤に持ち掛けた張本人であるが屯所移転の際、周平が近藤の養子になったことを理由に彼を個人部屋にするよう求めるも却下されて不平不満を漏らすなど、良家の出なのをいいことに横柄な態度を取る。武術の腕前も新選組内では大したものではなかったことから周囲からの信頼は低く、池田屋事件では、少数精鋭である近藤隊への所属を期待していたが、近藤や土方に「すまん、あんたじゃない」といなされ結局実現しなかった。河合が切腹することになった際の介錯を務めるも失敗、狼狽しているところを沖田が河合に止めを刺す、という武士にあるまじき醜態を晒したため、隊内で完全に孤立。その居心地の悪さを「わしの思っていた新選組とはかなりの隔たりがあった」、「そもそもこちら側から（新選組に）入ってやったんだ」と半ば逆恨み同然に新選組に見切りをつけると、弟達に脱走を持ちかけるが、近藤への恩に報いたい周平からは断られた為、仕方なく次弟である万太郎と2人で脱走を図るも山崎に察知され、先に屯所を抜け出して万太郎を待っていた所に斎藤、島田、浅野に捕捉される。切腹を勧められるも抵抗し、斎藤に槍で挑むも一太刀で切り捨てられる。新選組の体裁のために死因は見回り中に不逞浪士に切られたと島田によって偽装された。死後、土方からは「家柄がいいことに局長に取り入り、いい思いをしようとしたつまらん奴」と扱き下ろされている。
谷万太郎（たに まんたろう）
演：若松力
谷三兄弟の次男。池田屋事件では弟の昌武と共に近藤隊に所属し、池田屋の玄関先で死闘を繰り広げた。兄の三十郎と共に脱走を図るが、その際に半ば身勝手な理由で隊を抜ける事には若干の躊躇する様子を見せていた。その後、三十郎が殺された現場には姿を見せることなく逃亡した。
谷周平（たに しゅうへい）
（谷昌武→近藤周平→谷周平）
演：浅利陽介
谷三兄弟の末弟。長兄に無理矢理参加させられる形で入隊。当初の名は谷昌武で、のち近藤勇の養子となる。池田屋の時には近藤勇隊に属していたが、近藤の命により別働隊の土方、松原に浪士たちが集結していることを知らせる。周囲からの過剰な期待とは裏腹に当人は常にその重圧に苦悩しており、長兄三十郎から脱走を提案された際にはそれを断るも、その後、兄達がいなくなった事で周囲からの重圧や嫌がらせが更に増長する事となり、苦悩の末、浅野薫の脱走計画に半ば無理やりとはいえ参加してしまった事で近藤、沖田の怒りを買い、井上の必死の嘆願のおかげで切腹は免れたものの、養子縁組はいったん取り消しとなり、もとの谷姓に戻される。
それでも近藤家の跡取りにふさわしい男たらんと勉学、剣の稽古に励む彼を勇は最後は「近藤周平」と呼んだ。鳥羽伏見の戦いにも参加するが、官軍の猛攻を前に逃げ遅れ、結果的に井上が戦死する一因を作ってしまう。流山で勇の薦めによって隊を離れた。この時、彼を思う勇から「命を惜しめ」という、士道とは正反対のいたわりの言葉を与えられた。
大石鍬次郎（おおいし くわじろう）
演：根本慎太郎
若手で一番の人斬りである隊士。近藤と同じ多摩の出身で、本人は「腕だけを頼りに新選組に入った」と豪語するが、浅野曰く「思いっきり縁故で（新選組）に入っている」と評される。新選組の中でも特に過激な性格の持ち主で、新選組に仇なす者は誰であろうとも決して容赦せず、また一度でも新選組に対する反逆や、それをうかがわせる不穏な行動をとった者に対しても、如何なる理由があっても許さない程の疑心暗鬼と猜疑心の塊。それ故に血の気が多く、思い込みなどから暴走行為や軽率な行動に走りやすい危険な一面もある。
近藤の懐の深さを前に改心した武田や、同じく近藤と和解した伊東を、それぞれ独断で暗殺[15]する等、結果的に近藤の想いを水泡に帰し、新選組に混乱や災厄を齎す騒動を度々起こしているが、本人はそれらの行動が新選組の為であると疑いもしない。
また、周平を身内の七光りと見下し、ことあるごとにいじめていたが、剣の試合で敗れて和解した。
葛山武八郎（かづらやま ぶはちろう）
演：平畠啓史
諸士調役兼監察。池田屋事件の前に入隊。池田屋では、浪士と交戦し、追い詰められるが斎藤に救われている。さしたる理由もなく入隊した地味な男だが一方で読みが鋭く、建白書騒動では、隠密で行動したにもかかわらず近藤が事前に察知して登城していた状況から「建白書を出した一派の中に間者(斎藤)が潜んでいたのでは」と疑っていた。山南曰く「筆が立つ男」。永倉との掛け合いが多い。山南に頼まれ、永倉らが松平容保に提出した建白書を起草する。その一件で謹慎していたが、近藤が江戸に戻り、山南が外出している間に建白書を起草したことを理由に土方に切腹させられる。その際、斎藤が土方に顛末を密告していたことを悟り、「裏切り者！」と叫んで絶命する。その後、斎藤の夢の中に出現。以後、斎藤はしばらくこの事に苛まれる事になる。また、この騒動が、山南が脱走へと至る決定的なきっかけとなってしまった。
安藤早太郎（あんどう はやたろう）・新田革左衛門（にった かくざえもん）
演：河西祐樹（安藤）・赤堀二英（新田）
史実では、副長助勤であり野口が切腹する際の介錯を務めている。池田屋事件にて近藤勇の隊に所属するも、深手を負いその後亡くなる。
奥沢栄助（おくざわ えいすけ）
演：松島圭二朗
池田屋事件にて近藤勇の隊に所属し戦死する。
茨木司（いばらき つかさ）・佐野七五三之助（さの しめのすけ）・中村五郎（なかむら ごろう）・富川十郎（とみかわ じゅうろう）
演：大塚幸太（茨木）・安藤聖（佐野）・鈴木慶太（中村）・長倉正和（富川）
新選組隊士の直参取り立てに不満を持ち、武田に唆され御陵衛士に参加しようとするが断られ、京都守護職屋敷で自害する。
壬生浪士組
粕谷新五郎（かすや しんごろう）
演：伊吹吾朗
水戸藩出身。荒木又右衛門の再来といわれる剣豪。沖田、藤堂たちに慕われている。一番組小頭を希望し根岸に暴言を吐く芹沢を窘める。そして刀を抜きかけた芹沢を早業で止める。出立前に居酒屋で食事をしていた際に、芹沢派の野口に刀を抜かれるが、出立を告げに来た沖田と共にまたしても早業で刀を抜いて動きを封じた。
本庄宿では宿場の真ん中で焚き火をする芹沢を止めるよう沖田に懇願されるが、彼は芹沢の真意を見抜いており諭した。浪士組の江戸帰還の際には共に残るように沖田に説得されるが「もう少し若ければ」と言い断る。
しかし、再び近藤、沖田に説得されると仲間割れをしないことを条件に応じる。その後、殿内が殺されると、芹沢が殺したことは明白にもかかわらず下手人が不明だという近藤に不信感を募らせ、彼に対し今後の行く末を示唆させる予言めいた叱言を言い残しつつ壬生浪士組を脱退した。
殿内義雄（とのうち よしお）
演：生瀬勝久
上総の出身。剣の流派は「自己流」。浪士組結成の際には先番宿割をつとめるが、出発前に近藤に代わられる。代わられた後はどの組に属しているかわからず右往左往する有様であった。神経質で本庄宿では宿の担当であった沖田に一人部屋の布団部屋を用意させるが、結局は焚き火での野宿を諦めた芹沢と同宿となる。
浪士組の一部が京に残留した際に佐々木只三郎に命じられ、目付役として壬生浪士組に参加し京に留まる。佐々木の配下の柳に同志を募るよう誘われていることが発覚し、近藤に説得される。その後外出しているところを仲間を募りに大坂へ向かっていると思われ芹沢鴨に斬られる。しかし、実は江戸に戻り佐々木にすべて事情を説明した後、京へ戻り再び参加するとの近藤への手紙を残していた。
根岸友山（ねぎし ゆうざん）
演：奥村公延
かつて千葉周作に北辰一刀流を学んでいたが、浪士組結成の際には足もおぼつかない様子であった。浪士組では一番組小頭をつとめる。それを不満に思う芹沢に事あるごとに「ジジイ」と罵られていたことから、年寄り扱いされる事に激怒。
清川の江戸帰還後は壬生浪士組に参加し、京へ残留する。しかし、根岸も殿内同様、佐々木の息がかかっていた。殿内が殺されると、粕谷と共に壬生浪士組を脱退する。
阿比留鋭三郎（あびる えいざぶろう）
演：矢部太郎
井上源三郎に誘われ、病弱で江戸に帰る気力がないという理由で壬生浪士組に参加する。
壬生狂言を見に会津藩公用方が訪れた際に体調が悪く、席を外している時に佐々木の配下の柳が芹沢・近藤への牽制の為、殿内・根岸に同志を募るよう告げているのを目撃し、それを近藤たちに告げる。その後、大津の親戚の元で静養する為に隊を離れた。彼の脱退をもって、壬生浪士組は近藤派・芹沢派で完全に二分される事となる。
家里次郎（いえさと つぐお）・遠藤丈庵（えんどう じょうあん）
演：かなやす慶行（家里）・鈴木健（遠藤）
浪士組では一番組所属。後に壬生浪士組に参加するも粕谷や根岸らと共に脱退する。
浪士組
清河八郎（きよかわ はちろう）
演：白井晃
元は出羽庄内の郷士。山岡曰く「戦国の世に生まれていたらおそらく天下を獲っていた」程の人物。熱烈な尊王攘夷論者で、虎尾の会を結成し、ヒュースケンの暗殺を企てていた。将軍・徳川家茂の上洛に合わせ、将軍警護の為という名目で浪士組を創設するが、真の目的は尊王攘夷の先鋒とするためであった。鵜殿鳩翁、佐々木只三郎らは警戒し、京を目指す際、人目につく東海道より遠回りの中山道を進むことに決定してしまう。また、無役だった近藤を先番宿割に就かせ、土方から五十両受け取り、これを元手に浪士組一行とは別行動をとる。浪士を束ねることができるのは自分しかいないと思い知らせるためであったが、道中でも山岡を連絡役に浪士達の警戒を怠らなかった。京に到着後、佐々木たちの不在を狙って浪士たち235名の署名を集め、朝廷に建白書を提出して尊王攘夷の大義を果たすことを標榜する。浪士組を幕府から切り離そうとしたため、近藤・芹沢らは江戸帰還に反対、大騒ぎとなる。反発された事への憤りから、去り際に近藤と対面し、「あなたが夢見る武士の時代はもうすぐ終わる！」と皮肉を吐き捨てる。その後芹沢一派に狙われるが、近藤の手配により山南らと偶然居合わせた斎藤に救われる。江戸に帰還した後、佐々木に斬られる。
山岡鉄舟（やまおか てっしゅう）
（山岡鉄太郎→山岡鉄舟）
演：羽場裕一
当初の名は鉄太郎。近藤とは山南の仲介で出会う。幕臣ではあるが清河八郎の理解者で、浪士組取締として浪士組の結成にも参画する。のち精鋭隊歩兵頭格となり、勝海舟の元で幕府の後始末に尽力する。浪士組結成の際は清河から結成の真意を話され、彼のために周囲を出し抜く言動をするが、本人は裏表の無い人物で、勝海舟が甲陽鎮撫隊として近藤を甲府に行くように命じた時は「近藤をそこまで買っていたのですか」と言ったため、勝に「お前のようなのを西洋ではロマンチストと言うんだよ」と呆れられてしまう。
松平上総介（まつだいら かずさのすけ）
（松平主税助→松平上総介）
演：藤木孝
旗本。講武所教授方。当初の名は主税助。文久2年12月9日（1863年1月28日）、講武所剣術教授方兼任のまま、浪士取扱に任命される。桂小五郎に近藤勇を紹介され、講武所教授方見習に近藤勇を推薦した。しかし後に勇が百姓の出身であることが判明したため、冷たくあしらう。その後、浪士組取扱になるが、用意した支度金が足りなくなると仮病を装い責任逃れをする。近藤らが京で名を上げると掌を返して誉め讃えた。治安が乱れる京都の警備を担当させるために浪人を集めて浪士組を結成しようとした企画の責任者。
謀）として名前のみ登場する。
の青春群像劇という感じだった。当時でもすごかったが今改めて見るとものすごいキャスト陣である
近藤勇（こんどう いさみ）
（島崎勝太 → 近藤勇）
演：香取慎吾
局長。多摩の農家、宮川家の出身で幼名は宮川勝五郎。当初は島崎勝太（しまざき かつた）の名前で登場した。誠意の塊のような人物で、農家の出身故に、人一倍武士らしくありたいと思い、卑怯なことや道理に合わないことを好まない。それ故自分のためとはいえ辣腕をふるう土方を度々窘める一幕もあった。げんこつを丸ごと口に咥えこむという珍妙な特技を持つ。新選組と改めてからは、総髪になる。
天然理心流宗家・近藤周助の門下に入り、後に養子となり宗家4代目を襲名しながらも、時代が動き出していることを感じ自分の生き方を悩み続けていた。浪士組が募集されると、門弟である土方、沖田、山南、井上、永倉、藤堂、原田らと共に上洛する。そこで芹沢など様々な武人達との交流を隔てながら、時に苦渋を飲んだり、苦悩したりしながらも真の武士になる為に歩み続ける。清河との決別を経て壬生浪士組を結成し、芹沢、新見と共に局長に就任。隊を纏めていくことになるも、芹沢達の乱暴狼藉に手を焼く。土方達が粛清を決断した後も芹沢暗殺に踏み切れなかったが、やがて覚悟を決めた芹沢本人からの「鬼になって俺(芹沢)を食っちまえよ！」との言葉で暗殺に同意する。その後は京都守護職・松平容保のもと、新選組の局長として、内山彦次郎らを排斥しつつ京の治安維持や長州による政変などで活躍し、晴れて幕臣となる。
しかし政治状況は激変し、次第に幕府そして新選組は衰退の道を辿ることになる。隊では山南の脱走やその後の切腹、そして伊東や藤堂ら御陵衛士の分裂など様々な悲しい別離や苦難に当たる。それでもその真っ直ぐな志でぶつかり来る苦難を受け止め、一度は袂を分かった伊東とも和解するも、その矢先に先走り過ぎた若手隊士達の独断によって伊東が暗殺され、それをきっかけに御陵衛士との全面闘争へと発展した末、藤堂も戦死するという悲しい結果となった。後日、御陵衛士の生き残りによって近藤は銃撃され、治療のために大坂城へ行くが、その間に起きた鳥羽・伏見の戦いでは近藤達の兄的存在であった井上が戦死。次第に劣勢となる中、幕府軍艦で江戸へ引き揚げた後も徳川のために官軍と戦おうと画策したが、時勢はそれを許さなかった。勝海舟の要請によって甲陽鎮撫隊を率いて甲府城を目指すも、東山道を降ってきた新政府軍に敗れ、それが原因となり永倉、原田が離隊。その後大久保大和の変名を用い、武州五兵衛新田にて再起を図る。新たに隊士を集め、会津藩に合流するべく下総流山で隊士の調練を行っていた最中に新政府軍に包囲され、周平を離隊させ、さらに新選組を土方に託すと、単身新政府軍の陣地に連行される。土方に最後「トシ、もう疲れたよ」といった。養母ふでの励ましを皮切りに「お前は多摩の誇りぞ！」と周囲からの労いの声援を受け、「トシ」と呟いた直後、斬首の刃が振り下ろされた所で物語は終わる。
土方歳三（ひじかた としぞう）
演：山本耕史
副長。多摩の出身。近藤とは幼なじみで「かっちゃん」「トシ」と呼び合う無二の親友。極度の女好きで、それだけに伴侶を一人に選ぶつもりもない考えから、結婚を考えていない。多摩でも、周りが進めていたお琴との見合いをふいにし、不興を買っている。秀二郎がひでの男装であったのを見抜けず、相当悔しがっていたこともある。成長しつつも所々で逡巡する近藤と比べると、必要ならば謀略や暗殺も行う決断力に富んだ切れ者であり、また作戦立案や組織造りなどに抜群の才を発揮する知恵者だが、その知恵と洞察力から、仲間の不正を暴いてしまい、その不正が正義や人道の理由であっても切腹をさせてしまうなど、罪悪感から自身を苦しめることもある。普段は自分を律しているが近藤を「近藤さん」と公共の場では呼びながらも、感極まる出来事を体験した際には「かっちゃん」と呼び、自分に都合の悪い話をする際には目を違う所に向ける癖があるなど大人になれない部分もある。
一時は行商の道を志し家伝の石田散薬の行商をしていたりしたが、剣の道を志し天然理心流に入門する。一時は「剣は総司がいる。頭（知恵）は山南がついている」と考え、自分は近藤には必要ないのではないかと自信喪失するが、周斎に「山南の知恵は書物で学んだ知恵だ。お前の知恵は生きた知恵だ」と諭される。京に上ると近藤を大名にすることを狙うが、「八月十八日の政変」で自分たちが時勢の蚊帳の外にいることを痛感、近藤を日本一の侍にするために鬼になることを誓った。その後、芹沢暗殺を決意して山南・原田・井上（後に沖田も加入）、そして（この時、消極的だった）近藤を交えた芹沢暗殺計画を実行。斎藤の妨害に遭いつつも、芹沢の覚悟を汲み取って鬼となった近藤から「お前に浪士組の行く末託した」と告げられたことで自身も近藤の決意を受け止め、激闘の末に計画を成し遂げる。以後、近藤のために嫌われ役に徹し組織統制に辣腕をふるい多くの隊士を粛清したことから「鬼の副長」の異名で呼ばれるようになる。一方で山南や河合らを不本意ながら切腹させないといけなくなった場合や、自分達の意に反して藤堂を討ち死にさせてしまった際には人知れず涙を流した。江戸に帰った後は洋装になり、関東敗走後は内藤隼人の変名を使用。流山で近藤と訣別した後も宇都宮、会津、函館と新政府軍を相手に死場所を求めて戦い続ける。
2015年下期の連続テレビ小説『あさが来た』でも、山本は土方役として本作と同じ衣装・同じセリフで出演した[9]。
沖田総司（おきた そうじ）
（沖田惣次郎→沖田総司）
演：藤原竜也（少年時代：田辺季正）
副長助勤・一番組長。幼名は惣次郎（そうじろう）。試衛館の中でも最も剣の才能に恵まれ、若くして塾頭になり近藤をして「宗家5代目を襲名させたい」と言わしめる。無邪気で天真爛漫な性格だが、仲間内で一人前の大人として扱われないことに不満を持っていた。また剣に自信を持っているため最初に山南と試合して敗れた際には多少の引け目を感じていた。
上洛後は芹沢やお梅に魅せられて一時行動を共にしていた。それ故に「芹沢さんは自分が斬らねばならない」と理解し、芹沢暗殺事件では参加を志願。その後も池田屋事件などで活躍。肺結核を患い医者には静養を勧められるが、剣への情熱と責任感からかえって稽古や任務に熱を入れるようになり剣の鬼と化していく[10]。病気を隠していたもののある時、遂に皆の前で大量の血を吐いて昏倒して以降は療養生活となり、戦列を離れお孝の看病を受ける事になった。新選組が伏見に移転した時も京に残ったが、そこを浪士らに襲われる。しかし、お孝の機転で難を逃れ、銃撃され負傷した近藤と共に大坂城へ送られ松本良順の治療を受ける。江戸に戻った後は、病を圧して甲陽鎮撫隊に加わり多摩へ向かう。しかし、多摩で土方と剣術を立ち会っている時に倒れ、近藤に江戸に戻るように命じられる。植木屋平五郎宅で療養していたが襲撃される。その際、お孝を斬られ、襲撃してきた刺客を返り討ちにするが再度吐血し昏倒してしまう。本編ではその後に関する描写はなくナレーションで近藤の死を知らされぬまま病死したと語られるのみであり、総集編では姉のみつが「勇さんの後を追うように亡くなった」と語った（史実でも総司は近藤が斬首された約1か月後に病没している）。
悲劇の天才剣士と呼ばれる。
斎藤一（さいとう はじめ）
（山口一→斎藤一）
演：オダギリジョー
副長助勤・三番組長。剣の流派は不明だが隊中きっての達人で沖田と双璧をなす。無口かつ冷徹で自分から人と交わろうとすることはほぼ皆無だが、仲間を想う心を内に秘めており、徐々にそれを表に出す事が多くなっていく。また義理に厚く受けた恩を決して忘れない性格だが、そのことが災いして厄介な事態を惹き起こすこともある。坂本龍馬に岡田以蔵とどことなく似ていると言われた。よく短刀で彫刻を作っている。
最初は山口（やまぐち）一を名乗り、江戸で借金取りをしていた。近藤とは広岡子之次郎の借金を取り立てに来た時に出会う。人を斬って追っ手に追われている時、近藤の祝言が行われている近藤家に転がり込み匿われ、後に近藤の依頼を受けた芹沢の手引きで逃亡した。後に京の地で芹沢達が清河八郎を斬ろうとしている時に近藤たちの意を理解して清河を逃し、そのまま壬生浪士組に入隊する。芹沢暗殺の際には江戸の件で恩を忘れられず襲撃に向かう土方、沖田、山南、原田を阻止しようとするが、同じく義理のある近藤の仲裁により道を空ける。近藤や土方の依頼で暗殺や、複数の隊士の介錯を務めたことが多いが、夜魘される事もあった。伊東達が御陵衛士を結成した時には、間者として潜り込む。鳥羽・伏見の戦いで井上源三郎が戦死した時には激昂し、凄まじい怒声を上げながら狂ったように敵陣へ単独で斬り込んだ。甲陽鎮撫隊の敗戦後、隊を離れた永倉たちを「間違っている」と言い「この旗がある限り新選組は終わらない」と皆の前で隊旗を掲げて叫ぶ。
『最期の一日』では処刑された近藤の首級を彼が奪還し会津に持ち帰り土方、松平容保とともに弔ったとされている（ただし素性が分かると、近藤や新選組を恨む新政府軍の面々に墓荒らしにあうことを土方が懸念したため俗名は明記せず）。その際函館へ転戦する土方の代わりに近藤の首級と容保を護衛するべく会津に留まる。
なお、本編の最終回では容保から近藤の首級を奪回するよう密命を受け、その際に本物の虎徹を下賜されている。
藤堂平助（とうどう へいすけ）
演：中村勘太郎
副長助勤・八番組長。北辰一刀流伊東道場で学んでいたが、試衛館に入門する。誰に対しても礼儀正しく、とても穏やかで良識的な性格の反面、稽古は厳しく戦闘になると人が変わったように激情的な剣を振るう。天才剣士の沖田には常に引け目を感じていた。
一時は沖田になりすまして京の町で遊んでいたが近藤に諭される。池田屋事件では一番乗りの大役を果たし奮戦するも、汗を拭おうとした隙を衝かれ重傷を負い、額に傷が残ることになる。一時期江戸に帰還し近藤らとともに幕府へ長州征伐の談判を行う。主要人物の中では唯一山南の切腹に立ち会っておらず、京に帰還後に知らされた。後に師の伊東甲子太郎一派が入隊すると、試衛館の仲間達との間で葛藤する。御陵衛士に加わった後も伊東と近藤らの板挟みとなる。油小路の変では義を貫き御陵衛士として奮戦。永倉や原田たちは藤堂を助けようとするが、永倉の様子からその思惑を知りながらも逃げるばかりか、より一層激しい表情を浮かべて戦い続け、事情を知らない新選組隊士に背中を斬られる。そして駆けつけてきた近藤から「お前は、真の武士だ」と称賛され、皆の見守る中で穏やかな表情を浮かべながら息を引き取る。
原田左之助（はらだ さのすけ）
演：山本太郎
副長助勤・十番組長。伊予松山の出身。大坂谷道場で種田宝蔵院流を学んだ槍の名人で、鍵槍を愛用して数多くの修羅場で活躍する。底抜けに明るい三枚目で、近藤一派のムードメーカー的存在。かつて切腹しようとした時の傷があり、何かにつけてその傷を自慢したがる。常に何かを食べており、よく寝転がっている。
当ての無い旅の途中、滝本繁蔵の屋敷の護衛を頼まれた近藤たちと出会う。天然理心流4代目襲名の際の紅白試合に勝手に加わり、そのまま試衛館の食客となり、近藤らとともに浪士組に参加する。上述のようにお調子者的な面が目立つが、亡き夫と瓜二つということで可愛がられた八木久の死に対しては涙を見せ、落ち込んでしまう。さらに芹沢暗殺事件の際は敵に情けをかけて逆に斬られそうになった山南を助け「戦じゃなぁ、躊躇った方が負けなんだよ。先生」と諭すなど、実戦家としての面も見せた。甘味屋のまさに何度も思いを伝えては何度も断られるも、禁門の変で燃える京の町から彼女を助け出したことにより二人は結ばれる。甲陽鎮撫隊の敗戦後、永倉と共に隊を離れ、江戸で同志を集めようとしていた所、永倉が旧友と再会し、靖兵隊への参加を持ち掛けられるも旧友との縁から永倉が承諾したのに対し、「別の隊に加わるつもりはない」と拒否。永倉とは笑顔で分かれ、妻のいる京に戻ろうとする。近藤が板橋の刑場に引き立てられた際に現れ、「尽忠報国の士天晴れなり！新選組は不滅だ!!」と、涙ながらに熱いエールを送り、近くのお地蔵様に供えられていた菓子を食いながら「俺も不滅だ！」と言い、颯爽とどこかに駆け去っていった。上野戦争で戦死したとも、馬賊になったとも言われると最終回で説明されており、本編でもまさから「薩長の世の中になったらどうする」と聞かれた際、「大陸に渡って馬賊になる」と言っている。
山南敬助（やまなみ けいすけ）
演：堺雅人
副長、のち総長。仙台の浪人で北辰一刀流の門人であったが、同門の坂本龍馬から「（近藤勇は）面白い人物だ」と紹介されて興味を持ったのがきっかけで試衛館を訪れ、近藤の人柄に惹かれ門人となる。常に笑顔を絶やさず、何を口にするにも丁寧な口調で話す品のある人物。北辰一刀流免許皆伝で、最初に試合をした時には沖田を破り、直後の近藤との試合では「負けてみないと強さが分からない」と敢えて隙を作り近藤に勝たせる余裕を見せる程であった。その際、「彼（総司）はよい資質を持っている。必要なのは経験」と述べており、数年後には沖田に負かされている。学問にも明るく時勢を見極めていて、近藤を知の面から支える。
勇を浪士組の創設者・清河八郎、浪士組取締役・山岡鉄太郎と引き合わせ、浪士組への参加へのきっかけを作る。また、京で清河の浪士組から離れた時に会津藩の預りとするよう近藤に進言する。当初は副長を務めたが、土方により総長に棚上げされる。また、誠実で人斬りを望まない性分の為か芹沢暗殺事件では、土方を補佐し、平間を退けるが続く平山を斬ることができず、逆に斬られそうになったところを原田に救われる一幕もあった。そのため以後は、前線での戦闘には参加しなくなり、池田屋でも屯所に残留していた。
お互い認め合いながらも、度々土方とは対立し、屯所の本願寺移転でも反対するなど、論争は絶えなかった。その後、伊東らの入隊で、ますます自らの居所をなくしたと感じていく。隊のあり方に疑問を感じていた最中に起きた、永倉らの建白書提出に端を発する土方の処分をきっかけに、明里を伴って脱走したが、脱走と言っても身を隠したり先を急ぐことをせず（ただし明里に草津までは急ぐよう促す描写もあったが、結局は彼女のお転婆に振り回される形で足止めをくらってしまった）、まるで明里と連れ立って旅をするのも同然だった。馬で追いかけてきた沖田に近江の草津で見つかり、自ら声をかけて京に戻る。沖田は山南を逃がそうとしたが、その甲斐なく終わってしまった。そして、その死を惜しむ周囲の皆に事あるごとに再度の脱走を促されるが全て謝絶する。そして死別の言葉を残して志を託し、近藤、土方ら試衛館の仲間たちが見守る中、隊のために団結を願い、沖田の介錯のもと切腹。主要人物9人の中で最初の死者となった。
永倉新八（ながくら しんぱち）
演：山口智充
副長助勤・二番組長。神道無念流免許皆伝の達人。近藤や土方より年下だが容姿・言動共に老成しており、初対面の際に2人を驚かせる。筋が通っていない事や曲がった事を嫌う正義漢。左之助とはウマが合いよく一緒に行動している。
近藤とは滝本繁蔵の屋敷の護衛を頼まれた時に出会う。その後ヒュースケンを襲撃しようという賊の1人として再会するが、勇の必死の説得で思い留まり、勇達の側に寝返って賊を返り討ちにした。これがきっかけで勇の勧めもあって試衛館の食客になり、浪士組の一員として京へ赴く事になる。近藤の裏表の無い人柄に惚れ込んでいるがそれ故に「自分達は近藤勇の同志であって家来ではない」という意識が強い。そのため池田屋事件での報奨金分配や局長の権力を強める組織の命令系統の案に異を唱え、土方が口を滑らせて芹沢暗殺を暴露した事も追い打ちとなり（内部での争いを断固として認めないため、永倉は芹沢の暗殺を聞かされていなかった）、松平容保に建白書を提出するなど、しばしば近藤、土方の路線とは対立することもあった。
甲陽鎮撫隊の敗戦後、会津に行くことを近藤に提案するも受け入れられず、自分に従うよう命令する近藤に怒りを抱き左之助とともに隊を離れた。その後、左之助と共に江戸で同志を募る算段を考えていた所、旧友である市川宇八郎と再会し、縁から彼が立ち上げた靖兵隊に加わることを決める。近藤と決別こそしたものの、近藤の同志であるという思いは最後まで揺るがず、宇八郎が近藤を貶す発言をすると彼を強く叱責した。
井上源三郎（いのうえ げんざぶろう）
演：小林隆
副長助勤・六番組長（最初の隊内編成の際に土方から、副長に推挙されるが辞退している）。通称「源さん」。多摩出身で周助の代に試衛館の門人となった勇の兄弟子。温和な人物で常に勇や土方、沖田そして勇の養子周平などを見守っている、いわば父親的な存在である。新選組では最年長。
浪士組の結成の際には周斎から勇の「お目付役」として共に京へ上るよう頼まれる。新選組では地味ではあるものの組織の潤滑油として欠かせぬ存在となる。なお、劇中では一番長い刀を使っている。最後まで勇を支えた。鳥羽・伏見の戦いで周平を庇い新政府軍に奮戦するが、1度は正面からの一斉射撃を奇跡的にやり過ごすものの、周平に向かって振り向いた直後に背後からの銃弾を受け倒れる。その死は隊士達に衝撃を与え、土方は人目を憚らず号泣し、斎藤に至っては激昂し、凄まじい怒声と共に敵陣に突撃をかけた。死後幻影として療養中の勇の前に出現し、死してもなお勇の身を案じ続けていた。勇はその幻影が意味するものを察し、お目付役として共に上京した源三郎に「ここまで付き合わせてしまって悪かった」と述べそっと目を伏せ涙した。
水戸派（精忠浪士組）
芹沢鴨（せりざわ かも）
演：佐藤浩市
筆頭局長。水戸天狗党の出身で、同郷の新見や粕谷とは付き合いが長い。剣術・学問の実力を備えた一廉の人物で、プライドが高く傍若無人な面が目立つが、自分も他人も心から信じることが出来ず、自身の弱い部分を突かれると己を律しきれなくなる哀しい男でもある。酒癖が悪い。
近藤とは広岡子之次郎の稽古代の催促に来た時、山口（斎藤）一と共に料理屋の主人として出会う。水戸藩出身のため、桜田門外の変に参加する広岡を逃す。その際、近藤、山口に鯉のあらいを振る舞いながら「明日天地がひっくり返るような大事件が起きる」と語る。そして事件が起きた後、桜田門外に現れ酒を飲みながら「尽忠報国の士、天晴れなり」と叫ぶ。
その後、浪士組に参加。新見と共に三番組の小頭となる。先番宿割の役を与えられた近藤が本庄宿で芹沢が仲間と騒ぐので一人部屋を用意するよう佐々木に命じられ、宿の離れを用意されるが、鶏小屋であったため激怒、町の真ん中で焚き火をしながら野宿をし、周辺から燃やすものを仲間に集めさせ、浪士組の面々のみならず、巷の人々も困惑させた。しかし、近藤に根負けして焚き火を消すように命じた。このことで近藤に強い興味を持ち、その後浪士組が江戸に戻った後も京へ残留。近藤達と壬生浪士組（水戸派は精忠浪士組と名乗っていた）を結成。局長となる。
京では粗暴でやりたい放題な日々を送るが、その一方で自分とは違う真っ直ぐな生き方でありながら、自分に敬意を持って接してくる近藤に次第に引け目を感じるようになる。また、沖田に対しても自分の一派に加えるなど彼なりに一目置く。そんな破滅的ながらも、どこか哀愁を感じさせる生き様は沖田やお梅も魅せられた。自分が大坂相撲の力士達と起こした「どっこい事件」を近藤が実直な対応で解決に導いた事で、近藤に対するコンプレックスを更に募らせ、遂には商家の大和屋を襲うなど乱暴狼藉をエスカレートさせてしまう。
その結果、会津藩から見切りをつけられた事で、土方や山南は芹沢一派の排除を決意するが、近藤だけは芹沢への敬意や、その士道に背くような非情なやり方への抵抗感からなかなか決意できずにいた。一方、芹沢自身も新見の切腹による一件で自分が近く浪士組より排除される事を察するが、それを受け入れるかのように、粛清当日である「八月十八日の政変」の褒美を貰った祝宴の席で泥酔しながらも、自分を粛清する事に未だ決断を下せずにいる近藤に対して、「鬼になれよ。鬼になって俺を食っちまえよ。遠慮はいらねえよ」と自分の覚悟を告げつつ、容保から貰った「新選組」と書かれた文を見て「明日からこの名前で行けよ」と、自ら近藤の背中を押して、その決意を後押しした。
その後、土方、山南、原田、沖田は芹沢一派（粛清対象から外された野口以外）が八木邸に戻る道中を襲う予定であったが、斎藤の妨害に遭った事で予定がズレて、八木邸に戻り皆が寝静まった頃を見計らって芹沢の寝床に突入する。芹沢は白装束に着替え、酒を飲みながら座って待ち構えており、激戦の末、愛用の酒の入った瓢箪に足を取られた事で最後は沖田に刀を突かれ、土方にとどめを刺される。沖田は本来この襲撃には加担しない筈だったが、土方の態度から事情を察した沖田本人が刺客役に加わる事を希望し、芹沢も刺客達の中に沖田がいる事を確認した際に「嬉しいぜ」と零したり、沖田に刺された際にはどこか満足気な笑みを浮かべるなど、はじめから沖田の刃に倒れる事を望んでいたかのような節を見せた。死後この一件は土方によって長州藩士の仕業に偽装された。
近藤達が越えなければならない壁とされ、ドラマの前半を支える重要な役柄となっている。佐藤と脚本の三谷幸喜は「大河ドラマ史上最高の悪役」を狙ったという。また、佐藤の父である三國連太郎も1969年に公開された三船敏郎製作・主演の映画『新撰組』において、芹沢を演じており、親子二代で同じ役を演じた事で話題となった。
新見錦（にいみ にしき）
演：相島一之
局長、のち副長。芹沢の右腕的存在。学があるため、浪士組の上京後の清河八郎の朝廷への建白書の真意をつかみ、佐々木只三郎へ報告する。芹沢を理解し行動を共にしており、次第に組織内で顔が大きくなっていく近藤達を懸念して、芹沢と水戸派の地位を守る為に牽制を図るなど、試衛館派（特に土方・山南）に対して度々角を立てていた。
商家の大和屋の一件で芹沢から責任を押し付けられ、副長に降格、謹慎の処分を下される（その際に芹沢からは「腹を切れ」とまで言い渡されるが、その場では近藤達のとりなしで降格・謹慎で済まされた）。自身をぞんざいに扱ったことに不満を感じていたところを水戸派一掃を狙う土方と山南に突かれ、芹沢が又三郎を斬殺した顛末を報告して芹沢を売るように仕向けられる。同時に隊内を律するための局中法度が設けられたが、これは新見を体よく葬るためのものでもあり、土方・山南の策謀によって逆に仲間を陥れようとした「士道に背いた」罪で詰め腹を切らされ（芹沢の又三郎斬殺の一件に関しては法度制定の前の事であった為、不問とされた）、土方が渡した刀で切腹し、局中法度によって粛清された最初の犠牲者となった。その際、その後の新選組の行く末を予感させる恨み節を残している[11]。亡骸は、島田・松原によって運び出され葬られる事となった。
平山五郎（ひらやま ごろう）
演：坂田聡
副長助勤。史実では、新見の失脚後に局長に昇進したとされているが、本作では階級の昇降は見られない。左目に眼帯をしている。武芸の腕前だけなら新見以上の実力者である水戸派の中でも屈指の武闘派だが、反面、思慮が浅く、粗暴で軽挙な面が目立つ。近藤に無礼を働いたため、壬生狂言が八木家で行われた時外に出て斎藤に打擲される。また男装していた八木家の娘ひでに詰め寄ったために沖田に取り押さえられ、後の相撲大会では沖田と斎藤に完全に萎縮していた。芹沢暗殺の際には山南が平間と同様に逃がそうとしたが、平山は背後から山南に斬り掛かり、とっさに原田が投げた槍によって死亡した。
平間重助（ひらま じゅうすけ）
演：剛州
副長助勤。初期では隊内の勘定を任されており、同じく頭脳派である新見の補佐役として試衛館派への牽制などを行っていた。芹沢と行動を共にしていたが、芹沢暗殺の際には山南に逃がされ、そのまま何処かへと出奔した。
野口健司（のぐち けんじ）
演：岡本幸作
副長助勤。芹沢派の中では年若く、年齢の近い沖田や藤堂と親しかった。性格はやや好戦的な一面もあるが、芹沢派の中では比較的穏やかで、芹沢達の暴挙には無理矢理加担させられていたに等しかった為、芹沢の暗殺時には角屋に引き止められる形で粛清の対象から外された。水戸派が壊滅したのち史実では隊に残り、最終的には切腹することになるが、今作では水戸に帰郷するよう近藤や藤堂から勧められる描写があり、その場面を最後に姿を消す。
佐伯又三郎（さえき またさぶろう）
（又三郎→佐伯又三郎）
演：松谷賢示（水玉れっぷう隊）
副長助勤。元は八木家の奉公人であったが、本物の武士になるために京に残った浪士組に入隊、芹沢一派（水戸派）の腰巾着になる。本人は水戸派についた理由を「どうせ取り入るなら偉い奴の方がいい」と語っていたが、その芹沢本人からは「町人上がり」と忌み嫌われ、新見ら他の水戸派の者達からも然程相手にされていなかった。唯一同じく（一時的に）水戸派に属していた沖田とはそれなりに仲が良かった。かつての主である源之丞を含む町人達には傲慢な振る舞いを見せる一方、芹沢には常に胡麻を擂り続け、取り入ろうとするなど、一見すれば小物な人間であるが、その一方で武士への憧れの気持ちは本物であり、刀を買う為に八木家の奉公人時代から金を貯め続けていたり、芹沢からどれだけぞんざいに扱われようとも「このくらいの苦労は覚悟の上」と語るなど、努力家な一面もある。また、浪士組で羽織を考案する事になった際には京の市井の人々の意見を踏まえた上で近藤達に忠言するなど、稀に良識的な部分を覗かせる事もある。
ある晩、飲み屋に案内する途中でうっかり足を滑らせたはずみに持っていた提灯を芹沢にぶつけてしまった為に芹沢の怒りを買ってしまい、斬殺される。直前に彼から武士になる夢を聞かされていた沖田は悲壮に想う一方、斎藤は「取り入る相手を間違えた」と冷淡に一蹴した。
貯めていた金の入った財布は物盗りの犯行に見せるため新見に抜き取られるが、それが皮肉にも新見の命取りにつながった。
御陵衛士となった隊士（伊東道場一派）
伊東甲子太郎（いとう かしたろう）
（伊東大蔵→伊東甲子太郎）
演：谷原章介
参謀。当初の名は大蔵（おおくら）。文武に優れた品のある人物で、怜悧に時勢を見極め外国の知識にも精通しているが、それ故に人を見下す傾向が強い。神道無念流を学んでいたが、江戸に出て北辰一刀流剣術伊東道場に入門し、後に道場を継いだ。門下に藤堂平助がいた。ただし、彼らには試衛館派の土方や芹沢派の新見のような右腕的な補佐役は存在せず、加納、篠原が実質その役割を担った。浪士組には参加しなかったが、挨拶に来た藤堂に餞別を渡し、浪士組とのつながりを持とうとする。
江戸に隊士の募集に戻った近藤に対面し、新選組に入隊し参謀となり名を甲子太郎と改める。しかし、伊東の真意は新選組を尊王攘夷の先駆けとすることであった。その後、「薩長への偵察」との名目で脱隊を図るが、近藤や土方は伊東の本心を見抜きつつもかつての芹沢一派のような流血の事態を避けようと、表面上は騙されたふりをして伊東たちを送り出した。そして御陵衛士を結成するも、討幕派からは新選組にいた過去から信頼を得られず苦悶する。大久保一蔵にかつて新選組にいた過去をぬぐい去るために近藤を斬るよう唆され、近藤の別宅に招かれ伊東はその場で勇を殺害するつもりだったが、近藤から「あなたが弾かれるのは新選組にいたからではなく、彼らのように薩長の生まれではないからだ」と言われ、腹を割って心中を吐露し、自身も近藤から「私も生まれ故に幕府の武士から見下された。だからこそ新選組では生まれよりも士道を重んじた」との主張を聞く事で、互いに追い求める思想は違えども、国を想う気持ちは同じであった事に気が付き、和解する。
しかしその帰路で、事情を知らずに伊東を討ち取ろうと待ち構えていた大石鍬次郎率いる新選組の若手隊士達に襲撃され、近藤の想いを無下にするような彼らの軽率な行動を一喝しつつも、抗争を避けるべくあえて抵抗しようとせずに場を離れようとしたが、その隙を突かれる形で大石によって槍で刺殺されてしまう。その後、御陵衛士側に先立って事態を知った近藤は和解した矢先の伊東の死に愕然としつつも、これにより御陵衛士との抗争が避けられぬものとなってしまったことを悟った土方達に促され、やむなく彼らと刃を交えるという苦渋の決断を下した。
伊東の遺体は、土方の判断で七条油小路に放置され、彼の死を知った御陵衛士の隊士達はこれが罠だと気付くが、「たとえ罠でも、伊東先生の亡骸を晒し者にするわけにはいかない」という理由で現場へ行き、待ちかまえていた新選組との間でついに全面衝突が勃発。藤堂平助をはじめ両陣営に多くの犠牲を出すこととなる。
加納鷲雄（かのう わしお）
演：小原雅人
過激な言動の多い伊東一派にあっては温厚な人物で、仲間を諭したり外交役としての出番が多かった。藤堂平助が伊東大蔵に試衛館への移籍を願い出た際、永倉の提案で沖田と加納が立ち会い沖田が勝てば移籍を認めるという条件で立ち会うが敗れた。そして、「藤堂を譲る代わりに沖田が欲しい」という伊東を諫める。結果伊東は「（試衛館に）しばらくの間貸し付ける」と言いつつも、藤堂の移籍を認めた。沖田には敗れたものの剣術の心得が全く無いわけではなく、油小路の変では永倉と互角に渡り合っている。後に伊東と共に新選組に入隊する。御陵衛士として分派する時に土方とこれ以上隊士が加わることを禁止するとともに、御陵衛士から新選組に復帰することを禁止する取り決めを行った。油小路の変では篠原と共に御陵衛士を主導する。
事件後、復讐のために伏見街道で篠原らとともに近藤を狙撃する。しかし、闇討ちのようなやり方には若干躊躇していた。その後官軍に属して、流山で大久保大和と主張し尋問に行き詰まっていた香川、上田の命により近藤と再会する。そして旧交と任務の板挟みとなった彼に近藤は自ら「加納君、お久しぶりです」と語りかけ、加納もそんな近藤の心遣いを察しながら「ご無沙汰しております、局長」と返した。
篠原泰之進（しのはら たいのしん）
演：小梶直人
伊東一派でも特に好戦的な人物で、自身の主張を強引に押し通そうとする傾向があり、よく加納に諭されている。剣の腕前も確かで、不意を突かれたにもかかわらず斎藤、永倉と互角に渡り合った。長州藩との交渉に臨むべく広島に向かった近藤、伊東に同道する。御陵衛士に参加し、間者として潜り込んだ斎藤一が新選組に戻ろうとした際、斬り合いとなる。油小路の変では加納と共に御陵衛士を主導し、変後、復讐のために伏見街道で近藤を狙撃する。その際、「これでは闇討ちだ」と指摘する加納に対し、「構わん。奴ら(新選組)も散々汚い手を使ってきたではないか」と吐き捨てた。
服部武雄（はっとり たけお）
演：梶浦昭生
伊東と行動を共にする伊東一派随一の武闘派。間者として潜り込んだ斎藤一が新選組に戻ろうとした際、斬り合いになった篠原に加勢する。しかし、永倉たちが斎藤の応援に駆けつけたため、斎藤は難を逃れる。油小路の変では二刀流で奮戦するも敢え無く戦死する。
毛内有之助（もうない ありのすけ）
演：中川泰幸/現・中川邦史朗
油小路で戦死。
三木三郎（みき さぶろう）
演：平泉陽太
九番組長（第46回にて10番組編成の名簿に名前あり）。史実では伊東の実弟だがドラマ内では言及なし。間者として潜り込んだ斎藤一が新選組に戻ろうとした際、斎藤一と斬り合いになった篠原に加勢する。油小路の変より撤退した後、仲間と共に病身の沖田を襲撃するがお孝の機転によって未遂に終わる。
中西昇（なかにし のぼる）
演：猪狩賢二
伊東と行動を共にする。伊東一派が新選組を離れた後は登場しない。
その他の新選組隊士
前述の3つの派閥に属さない隊士達。なお、土方は第20回で行われた隊士募集で、採用された隊士（河合・松原等）は後々近藤派に属する事になると語っているが、実際は谷兄弟や大石など、近藤、土方の思惑に反して、各自勝手に行動する者も少なくない。また、武田はどの陣営にも中立である事を逆手にとって、近藤と伊東派の融和を試みた事もあるが、失敗している。
島田魁（しまだ かい）
演：照英
諸士調役兼監察。美濃出身の浪人で、旧知の永倉の推薦で入隊した。怪力の巨漢で、戊辰戦争では完全武装した永倉を片手一本で塀の上につり上げる場面が見られた。強面に似合わず人情家で、涙もろい感激家。人懐っこい性格であり、養子縁組を頼まれては断れず何度も姓が変わっている（なお、出生時の姓は「近藤」だった）。権力や地位にも全く固執せず、新選組が直参に引き立てられても当人の希望により平隊士であり続けた。普段は監察方として偵察や見張りに従事している。粛清に関わる事もある。ひとたび戦が始まると重い鎖帷子を全身にまとい大暴れする。正月には屯所のある西本願寺を訪れた子供達といっしょに遊ぶ姿も見られた。また、相撲大会に参加してふんどしが切れ、不浄負けするという一幕もあった。
『新選組!! 土方歳三 最期の一日』でも新選組の頭取として活躍するが、土方の死を知り号泣し、永井尚志に諭され、新選組を後世に語り継ぐことに誓った。晩年は西本願寺の警備を務めたと最終回で説明されている。
武田観柳斎（たけだ かんりゅうさい）
演：八嶋智人
副長助勤・五番組長。出雲国母里の出身で甲州流軍学を学んでいた。常に眼鏡をかけている。体躯にも恵まれぬゆえ学問や参謀で身を立てようと、浪士組が新選組と名を改めてからの隊士募集で入隊。剣技には秀でていないものの池田屋事件では、宮部一派の拠点の襲撃を提案し、戦闘では近藤隊に属して参加した。軍師として池田屋事件をはじめ数々の局面で近藤を支え続けるも、自信過剰な性格で人望に薄い、しかし近藤をはじめ、新選組の為に頑張っている武田の努力を認めている人間も少なくなく、武田を快く思っていなかった土方でさえも、新選組に対する思いを聞いたときは否定しなかった。何かと自分の手柄を強調することが多く、「軍師ですから」「私が〜」が口癖である。
甲州流軍学が時代に遅れつつあることを感じ取り、最先端の西洋軍学を学ぼうと隊費を管理していた河合から50両借りたが[12]、そのことが河合耆三郎切腹の原因となってしまう。これで評判を落とした武田は、直参取り立ての際に兵学師範であるということから他の副長助勤より格上の見廻組肝煎格への内示を受けるが、永倉、原田からは日頃の行いが悪く河合を切腹させた原因として不満だと異論が出た。そのため他の副長助勤と同格で納得するよう近藤に説得されるが、激怒して直参取り立てそのものを返上する。そして直参取り立てに不満な茨木、佐野、中村、富川らを御陵衛士へ参加するよう勧め、武田は話をつけに御陵衛士の元へ向かうが加納に参加を断られて立場の悪くなった四人が切腹してしまい、その事で新選組の隊士に尚更疎まれて居づらくなり、出奔。西洋軍学書を手土産に御陵衛士に参加しようとするが、伊東は既に西洋軍学書を手に入れており、しまいには「西洋軍学書を横取りして邪魔をした人間」として裏目に出てしまい伊東にはすげなく断られる。薩摩藩に縋ろうとするが、会津の軍事機密を持ってくるように西郷吉之助に言われる。行き場を無くしているところ、土方と沖田に隊に連れ戻される。本人は半ば自棄気味に切腹する覚悟は出来ていると嘯くが、近藤からは切腹を命じられることはなく、「自分のせいで死んだ者達の為にも生きる事で償え」「もう一度這い上がって来い」と諭され生き続けることを命じられる。改心して平隊士からやり直す決意をしたが、自分が恨みを買っていると自覚しているがゆえに、嫌がらせ[13]をされぬよう相部屋ではなく個室を所望した。しかしその直後、屯所を抜け出して河合の墓参に行ったのを沖田に見つかり、事情を話したことで見逃してもらうが、そのすぐ後に脱走と決めつけて追って来た大石鍬次郎らに背後から急襲され、落命する。
改心した矢先での突然の死に、直前まで話をしていた沖田と信頼していた近藤が武田の死を惜しんだ[14]。
河合耆三郎（かわい きさぶろう）
演：大倉孝二
勘定方。播磨の商家の出身。武術の才は皆無だがそろばんが得意で勘定方として隊の金銭面を支え続けた。愛想のいい人柄で、人の良いところを見つけるのが上手く、多くの人に好かれている。同郷の松原とは特に仲が良い。西洋軍学習得に熱意を燃やす武田観柳斎に兵法書の購入資金を捻出したことから、同じ本を狙っていた土方に勘定帳と隊費の数字が合わないことを詰問される。武田のことは口を割らず、親元から50両届けさせることを条件に勘弁してもらうように願い出て許されるが、親元から10日経っても50両は届かず切腹させられることになる。死への恐怖から、腹を切ろうとはしなかったが、ついに覚悟を決めた折に、介錯の谷三十郎がしくじってしまい血の海でもがいているところを沖田がとどめをさした。先述の切腹の際に往生際の悪さを見せてしまったものの、最後の最後まで武田を恨むことはなかった。親元からの金を届ける飛脚が到着したのは、皮肉にも切腹の直後だった。
山崎烝（やまざき すすむ）
演：桂吉弥
諸士調役兼監察。鍼医師の家の出身。浪士組が新選組と名を改めてからの隊士募集で入隊。三回入隊を志願してその度に断られていたが面接していた土方たちは覚えておらず、その人に覚えられにくい容貌や変装を利用して主に探索役を務める。内山彦次郎の悪事や伊東と倒幕派との密会、脱走を試みる隊士等を密かに探索する。また医術にも明るく、病に冒された沖田の病状を察知し、さらには西洋医学も学び伏見街道で御陵衛士の残党に狙撃された近藤を治療する。鳥羽・伏見の戦いで、土方、斎藤と共に不動村の屯所に戻った後、大坂へ引き揚げる途中に官兵に不意に顔を斬りつけられ重傷を負う。江戸へ向かう船の中で島田、尾関、尾形に看取られてひっそりと息を引き取った。
松原忠司（まつばら ちゅうじ）
演：甲本雅裕
四番組長。角刈りが特徴。剣術に加え関口流柔術の心得もあり、入隊時の立ち合いでは素手で斎藤を取り押さえるほどの腕前を見せる。事あるごとに「えいーやあー!!」と気合の掛け声をあげている。自分が殺した長州藩士の妻・お初を捨助が起こした祇園の火事から救うなどなにかと面倒をみている。しかし、そのことを「士道に背いた」と土方に糾弾され、本気で切腹を決意するほどに思いつめていたところ、「お礼がしたい」とお初に食事に招かれ、油断したところを刺され致命傷を負う。しかし斎藤がお初を殺そうとしたとき最後まで彼女を庇い、斎藤に斬られて絶命する。その後、葛山同様斎藤の夢の中に出現した。
尾関雅次郎（おぜき まさじろう）
演：熊面鯉
力の強さを見込まれ旗持ちを務める隊士。池田屋では屯所の守りについたが論功行賞が行われると、屯所の守備についた隊士は対象外という土方の方針により恩賞はもらえなかった。また永倉の建白書の一件では不本意ながらも永倉らと行動を共にして謹慎させられる。鳥羽・伏見の戦いでは銃弾を受けてもなお旗を振り続ける気迫を見せ、永倉率いる抜刀突撃でも先陣を切った。後に宇都宮、函館の戦いにも参戦している。
尾形俊太郎（おがた しゅんたろう）
演：飯田基祐
副長助勤。土方が十番組編成を提案した際の名簿では、後に採用された際とは異なり彼の名前が九番組長として記されていた。池田屋の論功行賞が行われたときに登場（それ以前にも近藤がつねに一筆啓上する際の回想で姿を見せている）。時勢を冷静に分析出来る人物で、山南の死後仲間達の解説役を担当することが多い。山南の遺言により新撰組の活動を詳細に記録していた。近藤の江戸帰還に同行する。近藤が流山で捕らえられたのを機に新選組に再起の道はないと隊を離脱した。新選組そのものともいうべき近藤の行く末を見届けるべく板橋の刑場に出向くがそこで（近藤を救出すべく殴りこみをかけてきた）原田左之助とばったり再会、その後、官軍兵に見つかったため2人して逃亡する。
浅野薫（あさの かおる）
演：中村俊太
諸士調役兼監察。大した実力も度胸も無いのに、功名心と自尊心だけは人一倍強い。池田屋の時には島田魁と共に見張りを担当するが、志願し近藤勇の隊に属する。しかし、斬り合いに怯えて茂みに身を隠す。論功行賞では、さしたる働きが無いまま近藤隊に所属しただけで恩賞をもらっており、一部始終を見ていた永倉が不満を抱く一因になっている。隊内部で繰り返される隊士粛清に身の危険を募らせていき、組長の一人である谷三十郎の粛清に関わったことが脱走を決める決定打となる。近藤周平をそそのかして脱走を図り、斎藤に追い詰められるが見逃され、そのまま何処かへと姿を消した。
谷三十郎（たに さんじゅうろう）
演：まいど豊
七番組長。谷三兄弟の長兄。土方があからさまに嫌悪するほどの甲高い笑い声が特徴。良家の出で槍術を学んでおり、新選組では槍術師範を受け持つ。浪士組が新選組と名を改めてから三兄弟揃って入隊した。弟である周平を近藤家の養子に出すことを近藤に持ち掛けた張本人であるが屯所移転の際、周平が近藤の養子になったことを理由に彼を個人部屋にするよう求めるも却下されて不平不満を漏らすなど、良家の出なのをいいことに横柄な態度を取る。武術の腕前も新選組内では大したものではなかったことから周囲からの信頼は低く、池田屋事件では、少数精鋭である近藤隊への所属を期待していたが、近藤や土方に「すまん、あんたじゃない」といなされ結局実現しなかった。河合が切腹することになった際の介錯を務めるも失敗、狼狽しているところを沖田が河合に止めを刺す、という武士にあるまじき醜態を晒したため、隊内で完全に孤立。その居心地の悪さを「わしの思っていた新選組とはかなりの隔たりがあった」、「そもそもこちら側から（新選組に）入ってやったんだ」と半ば逆恨み同然に新選組に見切りをつけると、弟達に脱走を持ちかけるが、近藤への恩に報いたい周平からは断られた為、仕方なく次弟である万太郎と2人で脱走を図るも山崎に察知され、先に屯所を抜け出して万太郎を待っていた所に斎藤、島田、浅野に捕捉される。切腹を勧められるも抵抗し、斎藤に槍で挑むも一太刀で切り捨てられる。新選組の体裁のために死因は見回り中に不逞浪士に切られたと島田によって偽装された。死後、土方からは「家柄がいいことに局長に取り入り、いい思いをしようとしたつまらん奴」と扱き下ろされている。
谷万太郎（たに まんたろう）
演：若松力
谷三兄弟の次男。池田屋事件では弟の昌武と共に近藤隊に所属し、池田屋の玄関先で死闘を繰り広げた。兄の三十郎と共に脱走を図るが、その際に半ば身勝手な理由で隊を抜ける事には若干の躊躇する様子を見せていた。その後、三十郎が殺された現場には姿を見せることなく逃亡した。
谷周平（たに しゅうへい）
（谷昌武→近藤周平→谷周平）
演：浅利陽介
谷三兄弟の末弟。長兄に無理矢理参加させられる形で入隊。当初の名は谷昌武で、のち近藤勇の養子となる。池田屋の時には近藤勇隊に属していたが、近藤の命により別働隊の土方、松原に浪士たちが集結していることを知らせる。周囲からの過剰な期待とは裏腹に当人は常にその重圧に苦悩しており、長兄三十郎から脱走を提案された際にはそれを断るも、その後、兄達がいなくなった事で周囲からの重圧や嫌がらせが更に増長する事となり、苦悩の末、浅野薫の脱走計画に半ば無理やりとはいえ参加してしまった事で近藤、沖田の怒りを買い、井上の必死の嘆願のおかげで切腹は免れたものの、養子縁組はいったん取り消しとなり、もとの谷姓に戻される。
それでも近藤家の跡取りにふさわしい男たらんと勉学、剣の稽古に励む彼を勇は最後は「近藤周平」と呼んだ。鳥羽伏見の戦いにも参加するが、官軍の猛攻を前に逃げ遅れ、結果的に井上が戦死する一因を作ってしまう。流山で勇の薦めによって隊を離れた。この時、彼を思う勇から「命を惜しめ」という、士道とは正反対のいたわりの言葉を与えられた。
大石鍬次郎（おおいし くわじろう）
演：根本慎太郎
若手で一番の人斬りである隊士。近藤と同じ多摩の出身で、本人は「腕だけを頼りに新選組に入った」と豪語するが、浅野曰く「思いっきり縁故で（新選組）に入っている」と評される。新選組の中でも特に過激な性格の持ち主で、新選組に仇なす者は誰であろうとも決して容赦せず、また一度でも新選組に対する反逆や、それをうかがわせる不穏な行動をとった者に対しても、如何なる理由があっても許さない程の疑心暗鬼と猜疑心の塊。それ故に血の気が多く、思い込みなどから暴走行為や軽率な行動に走りやすい危険な一面もある。
近藤の懐の深さを前に改心した武田や、同じく近藤と和解した伊東を、それぞれ独断で暗殺[15]する等、結果的に近藤の想いを水泡に帰し、新選組に混乱や災厄を齎す騒動を度々起こしているが、本人はそれらの行動が新選組の為であると疑いもしない。
また、周平を身内の七光りと見下し、ことあるごとにいじめていたが、剣の試合で敗れて和解した。
葛山武八郎（かづらやま ぶはちろう）
演：平畠啓史
諸士調役兼監察。池田屋事件の前に入隊。池田屋では、浪士と交戦し、追い詰められるが斎藤に救われている。さしたる理由もなく入隊した地味な男だが一方で読みが鋭く、建白書騒動では、隠密で行動したにもかかわらず近藤が事前に察知して登城していた状況から「建白書を出した一派の中に間者(斎藤)が潜んでいたのでは」と疑っていた。山南曰く「筆が立つ男」。永倉との掛け合いが多い。山南に頼まれ、永倉らが松平容保に提出した建白書を起草する。その一件で謹慎していたが、近藤が江戸に戻り、山南が外出している間に建白書を起草したことを理由に土方に切腹させられる。その際、斎藤が土方に顛末を密告していたことを悟り、「裏切り者！」と叫んで絶命する。その後、斎藤の夢の中に出現。以後、斎藤はしばらくこの事に苛まれる事になる。また、この騒動が、山南が脱走へと至る決定的なきっかけとなってしまった。
安藤早太郎（あんどう はやたろう）・新田革左衛門（にった かくざえもん）
演：河西祐樹（安藤）・赤堀二英（新田）
史実では、副長助勤であり野口が切腹する際の介錯を務めている。池田屋事件にて近藤勇の隊に所属するも、深手を負いその後亡くなる。
奥沢栄助（おくざわ えいすけ）
演：松島圭二朗
池田屋事件にて近藤勇の隊に所属し戦死する。
茨木司（いばらき つかさ）・佐野七五三之助（さの しめのすけ）・中村五郎（なかむら ごろう）・富川十郎（とみかわ じゅうろう）
演：大塚幸太（茨木）・安藤聖（佐野）・鈴木慶太（中村）・長倉正和（富川）
新選組隊士の直参取り立てに不満を持ち、武田に唆され御陵衛士に参加しようとするが断られ、京都守護職屋敷で自害する。
壬生浪士組
粕谷新五郎（かすや しんごろう）
演：伊吹吾朗
水戸藩出身。荒木又右衛門の再来といわれる剣豪。沖田、藤堂たちに慕われている。一番組小頭を希望し根岸に暴言を吐く芹沢を窘める。そして刀を抜きかけた芹沢を早業で止める。出立前に居酒屋で食事をしていた際に、芹沢派の野口に刀を抜かれるが、出立を告げに来た沖田と共にまたしても早業で刀を抜いて動きを封じた。
本庄宿では宿場の真ん中で焚き火をする芹沢を止めるよう沖田に懇願されるが、彼は芹沢の真意を見抜いており諭した。浪士組の江戸帰還の際には共に残るように沖田に説得されるが「もう少し若ければ」と言い断る。
しかし、再び近藤、沖田に説得されると仲間割れをしないことを条件に応じる。その後、殿内が殺されると、芹沢が殺したことは明白にもかかわらず下手人が不明だという近藤に不信感を募らせ、彼に対し今後の行く末を示唆させる予言めいた叱言を言い残しつつ壬生浪士組を脱退した。
殿内義雄（とのうち よしお）
演：生瀬勝久
上総の出身。剣の流派は「自己流」。浪士組結成の際には先番宿割をつとめるが、出発前に近藤に代わられる。代わられた後はどの組に属しているかわからず右往左往する有様であった。神経質で本庄宿では宿の担当であった沖田に一人部屋の布団部屋を用意させるが、結局は焚き火での野宿を諦めた芹沢と同宿となる。
浪士組の一部が京に残留した際に佐々木只三郎に命じられ、目付役として壬生浪士組に参加し京に留まる。佐々木の配下の柳に同志を募るよう誘われていることが発覚し、近藤に説得される。その後外出しているところを仲間を募りに大坂へ向かっていると思われ芹沢鴨に斬られる。しかし、実は江戸に戻り佐々木にすべて事情を説明した後、京へ戻り再び参加するとの近藤への手紙を残していた。
根岸友山（ねぎし ゆうざん）
演：奥村公延
かつて千葉周作に北辰一刀流を学んでいたが、浪士組結成の際には足もおぼつかない様子であった。浪士組では一番組小頭をつとめる。それを不満に思う芹沢に事あるごとに「ジジイ」と罵られていたことから、年寄り扱いされる事に激怒。
清川の江戸帰還後は壬生浪士組に参加し、京へ残留する。しかし、根岸も殿内同様、佐々木の息がかかっていた。殿内が殺されると、粕谷と共に壬生浪士組を脱退する。
阿比留鋭三郎（あびる えいざぶろう）
演：矢部太郎
井上源三郎に誘われ、病弱で江戸に帰る気力がないという理由で壬生浪士組に参加する。
壬生狂言を見に会津藩公用方が訪れた際に体調が悪く、席を外している時に佐々木の配下の柳が芹沢・近藤への牽制の為、殿内・根岸に同志を募るよう告げているのを目撃し、それを近藤たちに告げる。その後、大津の親戚の元で静養する為に隊を離れた。彼の脱退をもって、壬生浪士組は近藤派・芹沢派で完全に二分される事となる。
家里次郎（いえさと つぐお）・遠藤丈庵（えんどう じょうあん）
演：かなやす慶行（家里）・鈴木健（遠藤）
浪士組では一番組所属。後に壬生浪士組に参加するも粕谷や根岸らと共に脱退する。
浪士組
清河八郎（きよかわ はちろう）
演：白井晃
元は出羽庄内の郷士。山岡曰く「戦国の世に生まれていたらおそらく天下を獲っていた」程の人物。熱烈な尊王攘夷論者で、虎尾の会を結成し、ヒュースケンの暗殺を企てていた。将軍・徳川家茂の上洛に合わせ、将軍警護の為という名目で浪士組を創設するが、真の目的は尊王攘夷の先鋒とするためであった。鵜殿鳩翁、佐々木只三郎らは警戒し、京を目指す際、人目につく東海道より遠回りの中山道を進むことに決定してしまう。また、無役だった近藤を先番宿割に就かせ、土方から五十両受け取り、これを元手に浪士組一行とは別行動をとる。浪士を束ねることができるのは自分しかいないと思い知らせるためであったが、道中でも山岡を連絡役に浪士達の警戒を怠らなかった。京に到着後、佐々木たちの不在を狙って浪士たち235名の署名を集め、朝廷に建白書を提出して尊王攘夷の大義を果たすことを標榜する。浪士組を幕府から切り離そうとしたため、近藤・芹沢らは江戸帰還に反対、大騒ぎとなる。反発された事への憤りから、去り際に近藤と対面し、「あなたが夢見る武士の時代はもうすぐ終わる！」と皮肉を吐き捨てる。その後芹沢一派に狙われるが、近藤の手配により山南らと偶然居合わせた斎藤に救われる。江戸に帰還した後、佐々木に斬られる。
山岡鉄舟（やまおか てっしゅう）
（山岡鉄太郎→山岡鉄舟）
演：羽場裕一
当初の名は鉄太郎。近藤とは山南の仲介で出会う。幕臣ではあるが清河八郎の理解者で、浪士組取締として浪士組の結成にも参画する。のち精鋭隊歩兵頭格となり、勝海舟の元で幕府の後始末に尽力する。浪士組結成の際は清河から結成の真意を話され、彼のために周囲を出し抜く言動をするが、本人は裏表の無い人物で、勝海舟が甲陽鎮撫隊として近藤を甲府に行くように命じた時は「近藤をそこまで買っていたのですか」と言ったため、勝に「お前のようなのを西洋ではロマンチストと言うんだよ」と呆れられてしまう。
松平上総介（まつだいら かずさのすけ）
（松平主税助→松平上総介）
演：藤木孝
旗本。講武所教授方。当初の名は主税助。文久2年12月9日（1863年1月28日）、講武所剣術教授方兼任のまま、浪士取扱に任命される。桂小五郎に近藤勇を紹介され、講武所教授方見習に近藤勇を推薦した。しかし後に勇が百姓の出身であることが判明したため、冷たくあしらう。その後、浪士組取扱になるが、用意した支度金が足りなくなると仮病を装い責任逃れをする。近藤らが京で名を上げると掌を返して誉め讃えた。治安が乱れる京都の警備を担当させるために浪人を集めて浪士組を結成しようとした企画の責任者。
謀）として名前のみ登場する。
