追補
毒性の強い腸内細菌が造血幹細胞移植の重篤な合併症を引き起こすことを発見 -ファージ由来の溶菌酵素による新規治療薬の開発へ-
2024年7月11日
ポイント
◇造血幹細胞移植患者の腸管内で毒性の強い腸内細菌を特定。
◇この腸内細菌はバイオフィルム※1を形成し、腸管内で増加していることが明らかに。
◇メタゲノム解析から同定したファージ由来の溶菌酵素（エンドライシン※2）で、バイオフィルムごと菌を溶解。
◇エンドライシンの投与が移植片対宿主病（GVHD）の悪化を抑制し、死亡率を大幅に改善することをマウスで確認。
概要
近年、“腸内細菌叢の乱れ”がさまざまな疾患で見られることが、ゲノム解析技術の向上により明らかになってきました。臓器移植では、免疫細胞が移植された臓器を異物とみなして攻撃し、拒絶反応が起こります。白血病治療などで行われる造血幹細胞移植では、移植された造血幹細胞由来の免疫細胞が、移植患者の臓器を異物とみなし攻撃する「移植片対宿主病（GVHD）」を発症することがあります。これまでの研究で、造血幹細胞移植の治療過程で腸内細菌叢のバランスが乱れ、エンテロコッカス属の細菌が増加することで、GVHDが悪化することが報告されていました。
大阪公立大学大学院医学研究科ゲノム免疫学の植松 智教授（東京大学医科学研究所附属ヒトゲノム解析センターメタゲノム医学分野特任教授を兼任）、藤本 康介准教授（東京大学医科学研究所附属ヒトゲノム解析センターメタゲノム医学分野特任准教授を兼任）らと、東京大学医科学研究所附属ヒトゲノム解析センター健康医療インテリジェンス分野の井元 清哉教授らの共同研究グループは、大阪公立大学医学部附属病院の造血幹細胞移植（同種移植）患者46名の糞便のメタゲノム解析を実施。46名のうち30名でエンテロコッカス属の細菌が増加していることを明らかにしただけでなく、一部の症例で毒性の強いエンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）が存在し、GVHDの発症に関わることを見出しました。
造血幹細胞移植の治療では、感染症から身を守るために抗菌薬を使用しますが、この毒性の強いE. faecalisは腸管内でバイオフィルムを形成することで、抗菌薬から逃れて増殖していると考えられました。また、毒性の強いE. faecalisを定着させたマウスでは、GVHDが悪化することが明らかとなりました。そこで本研究グループは、E. faecalisに特異的に作用し、バイオフィルムを破壊することが可能な溶菌酵素を探索するため、E. faecalisのメタゲノム解析を行いました。その結果、新規の溶菌酵素（エンドライシン）の配列を同定し、その精製に成功しました。このエンドライシンを毒性の強いE. faecalisを定着させたGVHDモデルマウスに投与したところ、GVHDの悪化を抑制し死亡率が大幅に改善することを確認しました。本研究で得られたファージ由来のエンドライシンは、今後GVHDの新規治療薬の開発に繋がることが期待されます。
本研究成果は、日本時間2024年7月11日（木）に国際学術誌「Nature」のオンライン速報版に掲載されました。
同種造血幹細胞移植は治療効果の高い治療法ですが、GVHDなどの重篤な合併症のリスクがあります。同種移植患者の腸内では毒性の強いE. faecalisが増加し、それによりGVHDの病態が悪くなりやすいことを明らかにしました。さらに、E. faecalisに特異的な溶菌酵素エンドライシンを同定し、世界に先駆けて生体内でのその有効性を示しました。本研究成果は将来的なGVHDの新規予防法・治療法に繋がることが強く期待されます。
藤本 康介准教授
掲載誌情報
【発表雑誌】Nature
【論文名】An enterococcal phage-derived enzyme suppresses graft-versus-host disease
【著者】Kosuke Fujimoto†, Tetsuya Hayashi†, Mako Yamamoto, Noriaki Sato, Masaki Shimohigoshi, Daichi Miyaoka, Chieko Yokota, Miki Watanabe, Yuki Hisaki, Yukari Kamei, Yuki Yokoyama, Takato Yabuno, Asao Hirose, Mika Nakamae, Hirohisa Nakamae, Miho Uematsu, Shintaro Sato, Kiyoshi Yamaguchi, Yoichi Furukawa, Yukihiro Akeda, Masayuki Hino, Seiya Imoto*, and Satoshi Uematsu* （†共同筆頭著者、*共同責任著者）
【掲載URL】https://doi.org/10.1038/s41586-024-07667-8
用語解説
※1 バイオフィルム…微生物や微生物が産生するさまざまな物質が集合してできた構造体。微生物自身が産生する物質（菌体外多糖類など）によって微生物を覆う形で形成される。バイオフィルム内では微生物は増殖を繰り返す。
※2 エンドライシン…ファージが細菌を破壊するための酵素。細菌の細胞壁を構成するペプチドグリカンを分解する。
研究内容に関する問い合わせ先
大阪公立大学大学院医学研究科
准教授 藤本 康介（ふじもと こうすけ）
TEL：06-6645-3926
E-mail：kfujimoto[at]omu.ac.jp
※[at]を@に変更してください。
Epigenetic gene regulation in the bacterial world
多くの真核生物と同様に、バクテリアはDNA-タンパク質相互作用のエピジェネティックな制御のために、複製後のDNAメチル化を広く利用している。しかし、真核生物とは異なり、細菌はエピジェネティックなシグナルとしてDNAシトシンメチル化ではなく、DNAアデニンメチル化を利用する。DNAアデニンメチル化は、病原性大腸菌、サルモネラ菌、ビブリオ菌、エルシニア菌、ヘモフィルス菌、ブルセラ菌など、ヒトや家畜の様々な病原体の毒性に関与している。アルファプロテオバクテリアでは、CcrMメチラーゼによるGANTC部位のアデニンのメチル化が細胞周期を制御し、遺伝子転写とDNA複製を結合させる。ガンマプロテオバクテリアでは、DamメチラーゼによるGATC部位のアデニンメチル化が、DNA複製、染色体分離、ミスマッチ修復、バクテリオファージゲノムのパッケージング、トランスポゼ活性、遺伝子発現制御のシグナルを提供する。ダムメチル化による転写抑制は、転写活性化よりも一般的であるように思われる。ある種のプロモーターは、DNA複製に続くヘミメチル化期間のみ活性化され、新たに合成されたDNA鎖がメチル化されると、抑制が回復される。しかし、大腸菌のゲノムでは、特定のGATC部位のメチル化が、同種のDNA結合タンパク質によってブロックされることがある。細胞分裂後にGATCのメチル化が阻害されると、DNAメチル化パターンが娘細胞に伝達され、それぞれ正帰還ループによって伝播される異なるエピジェネティック状態が生じる可能性がある。DNAメチル化パターンの切り替えは、真核細胞の分化を彷彿とさせる方法で、クローン性細菌集団をエピジェネティックな系統に分割することができる。自己増殖するDNAメチル化パターンの継承は、大腸菌のpapオペロン、agn43遺伝子、および病原性に関連する細胞表面機能をコードする他の遺伝子座の位相変化を支配している。
Bacterial DNA Methylation and Methylomes
細菌ゲノム中のC5-メチルシトシン、N4-メチルシトシン、N6-メチルアデニンの形成は、ポストレプリケートであり、S-アデノシル-メチオニンから特定のDNA配列に埋め込まれた塩基へのメチル基の転移が必要である。バクテリアのDNAメチル化酵素の多くは制限修飾系に属し、さらに「孤立型」あるいは「オーファン」DNAメチル化酵素がバクテリアおよびファージのゲノムに頻繁に見いだされる。塩基メチル化は、DNA結合タンパク質とその同定部位との相互作用に、直接的な効果（例えば、立体障害）あるいはDNAトポロジーの変化により影響を与えることがある。アルファプロテオバクテリアとガンマプロテオバクテリアの両方において、DNA塩基メチル化の役割は、染色体複製の制御、ヌクレオイド分離、DNAミスマッチの複製後の修正、細胞周期と結合した転写、細菌細胞系列の形成、細菌の病原性の制御など、特にN6-methyladenineがよく知られている。近年、DNAメチル化のゲノムレベルでの解析が可能となり、バクテリアのDNAメチル化の範囲、進化、生理的意義に関する知見が広がっている。
Progress in Retinal and Eye Research
Epigenetics, microbiota, and intraocular inflammation: New paradigms of immune regulation in the eye
網膜・眼科研究の進歩
64巻、2018年5月、84-95ページ
エピジェネティクス、マイクロバイオータ、眼内炎症。眼における免疫制御の新たなパラダイム
要旨
眼球を損傷する視力を脅かす免疫応答は、眼内炎症性疾患の特徴である。ぶどう膜炎や加齢黄斑変性症を含むこれらの疾患は、心配するほど一般的で、QOL（生活の質）を著しく低下させる。過去数十年の遺伝学的研究により、これらの壊滅的な疾患の病因に関する理解は著しく進んだ。しかし残念ながら、患者の遺伝学だけでは、疾患の起源、感受性、進行について十分な説明ができませんでした。眼疾患のエピジェネティックな制御や眼内炎症を誘発する環境因子などの非遺伝的因子は、眼内炎症性疾患に対する新しい知見を提供するものである。重要なことは、ヒトの微生物叢の異常が宿主細胞の迅速なエピゲノム再プログラムにつながり、多くの疾患の発症につながることを示す証拠が増えつつあることである。本総説では、エピジェネティックなメカニズムと微生物叢がどのように協調して眼炎症が発症し、永続化するのかを論じる。最後に、眼内細菌叢の発見は、ぶどう膜炎や加齢黄斑変性症などの眼内炎症性疾患の診断、治療、予防に対する現在のアプローチに影響を与える重要な思想の転換をもたらすことを提案する。眼内炎症性疾患の病態や遺伝的関連性における地理的・遺伝的背景の違いは、眼内細菌叢の変動に起因している可能性がある。
目よりも皮膚常在菌のほうが興味深い よく誤解されるけどニキビは感染症ではありません。炎症にアクネ菌が密接にかかわって います。アクネ菌はメジャーな皮膚常在菌なのです。ホルモンバランスの乱れから皮脂が過剰に分泌され、毛穴が詰まることでニキビが引き起こされると言われますが、肌を守ろうとして皮脂が過剰に分泌され、毛穴が詰まりやすい肌になってしまうことが原因と言われますがアクネ菌がメジャーな常在菌の皮膚の理は本当にそうでしょうか？実はマラセチアという真菌との共生が関係する。
アクネ菌は皮膚の表面に、コプロポルフィリンという蛍光性の代謝物を排出します。このポルフィリンに紫外線があたると、一重項酸素が発生します。一方、ニキビ肌の皮膚から検出される活性酸素も一重項酸素です。このことから、ニキビ肌をひきおこす活性酸素ポルフィリンと紫外線から生産される一重項酸素
■ Propionibacterium acnes からの菌体DNAの抽出方法
【質問】
今回, 新たな壁にぶつかってしまいました。もしも可能でしたら, 回答を頂けたらと思います。
Propionibacterium acnes (グラム陽性菌) の「16SリボゾームDNA」領域をPCRしたいと考えております。その際, P. acnes コロニーからのDNA抽出のステップが入りますが, このステップについてです。実験書を頼りに一度 (リゾチーム・フェノールを基本とした抽出法) を行ってみましたが, PCRで目的のバンドを検出することが出来ませんでした。グラム陽性菌からのDNA抽出は難を要すると聞きます (PCR操作自体は他のサンプルを用いた実験で, P. acnesが増幅されることは確認済みです)。時間のあるときでかまいませんので, ご回答を頂けたらと思います。
どうぞ宜しくお願い致します。
【回答】
グラム陽性菌ですので, リゾチームの使用には問題がある場合があるでしょう。陽性菌の細胞壁のおだやかな破壊には, リゾチ－ムがうまく働かない場合には, その代わりにアクロモペプチダーゼ (和光) がよく使用されています。ところで御質問の, Propionibacterium DNAのPCR増幅については, 金沢大学医学部保健学科検査学講座の中村雅彦らが, 16S rRNAとlipase遺伝子に対するプライマーを設計, 使用して, 増幅に成功していますので, その方法を参考にして下さい。また東京医科歯科大学病因病理の江石義信らは, サルコイドーシス患者のリンパ節組織切片から, Proteinase K (和光) の処理と, Qiaamp Tissue Kit (Qiagen, Varencia, CA, USA)を使用して, Propionibacterium DNAを回収していますので, その試薬キットの成分を調べて参考にしてはいかがでしょう。プライマーの設計についての情報もあります。
・生物性状試験とPCRによるPropionibacterium acnesの鑑別法の比較検討. 第13回日本臨床微生物学会総会ポスター発表 (東京), 2002. 1
・諸外国サルコイド－シス患者からの生検リンパ節における細菌DNAの検出と定量解析. 平成12年度「厚生科学研究」 特定疾患対策研究事業 「びまん性肺疾患研究報告書」p 45～52, (平成13年3月)
(岐阜大学・渡邉邦友)
皮膚炎症プロセスの制御は、ヒトの皮膚が、この器官に通常生息している微生物の密集したコミュニティの存在下で、恒常性を維持するために不可欠である。毛包に関連した皮脂腺を形成する皮脂細胞は、特殊な脂質産生細胞であり、炎症性メディエーターを放出することができます。毛包上皮細胞、すなわち皮脂細胞および毛包ケラチノサイトによるサイトカインおよびケモカインの発現は、一般的なヒトの皮膚疾患である尋常性ざ瘡に関与していることが提唱されている。しかし、皮脂腺上皮細胞は、ほとんどの場合、細菌を高濃度に含んでいるにもかかわらず、炎症反応を示すのは一部の細胞に限られており、ニキビに関与する毛包上皮細胞における炎症性遺伝子発現を促進する基礎メカニズムはまだわかっていない。本研究では、皮膚常在微生物であるPropionibacterium acnesの代謝物が、ヒト脂芽球のサイトカイン発現に影響を与える可能性があると仮定している。Propionibacterium acnesが発酵に適した環境条件下で産生する短鎖脂肪酸（SCFAs）が、皮脂細胞からの炎症性遺伝子発現を促進することを示す。これらの分子は、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）活性の阻害と脂肪酸受容体の活性化という2つの異なるメカニズムによって、脂芽球の挙動に影響を与えることが示された。ヒトの皮脂細胞におけるHDAC8とHDAC9の枯渇は、ニキビ病巣の転写プロファイルに類似したToll様受容体2の活性化に対するサイトカイン応答の増強をもたらした。これらのデータは、皮膚における炎症性遺伝子発現の制御に関する新たな知見を提供し、表皮免疫に対する皮脂細胞の寄与をさらに特徴づけるとともに、皮膚マイクロバイオームの代謝状態の変化が炎症性ニキビを促進することを実証している。
尋常性ざ瘡は、毛包と皮脂腺が関与する炎症性の皮膚疾患です。慢性皮膚疾患の世界的な疾病負担の第3位であり、にきびは重大な医療問題であり、医療費の主要な原因となっています(1)。この疾患では、皮膚常在菌であるCutibacterium acnes（旧名Propionibacterium acnes（2）、以下P. acnes）が皮膚炎症を引き起こす要因であると広く考えられています（3）。P. acnes上に存在するToll-like Receptor-2 (TLR2) リガンドは、ケラチノサイトや単球などの細胞から炎症性遺伝子の発現を開始させることが示されている(4-7)。しかし、P. acnesは、健康な皮膚に存在する微生物群の豊富なメンバーであり、これらのTLRリガンドの存在によって炎症が活性化されることはない（8, 9）。さらに、皮脂腺毛包の大部分にこの微生物が存在するにもかかわらず、ニキビに特徴的な炎症を示すのは、常にごく少数の選ばれた人たちだけである。このように、P. acnesに対する炎症反応を制御する重要な基礎的事象は完全には理解されていない。
そこで我々は、皮脂腺毛包の局所的な微小環境の変化がP. acnesの代謝活性を変化させ、この代謝産物の局所的な変化がニキビに見られる炎症反応を促進させるという仮説を立てた。この仮説を支持するものとして、我々は、皮脂腺が閉塞した状態を模倣した低酸素で脂質の多い条件下でP. acnesが産生する短鎖脂肪酸（SCFA）が表皮ケラチノサイトに強い炎症促進作用を持つことを明らかにした（10）。SCFAで処理したケラチノサイトは、TLR活性化に対するサイトカイン応答の増大を示した。これは、骨髄由来の細胞に対するSCFAのよく知られた抗炎症効果とは逆の、ケラチノサイト炎症反応の明確で顕著な表現型である(11-13)。ケラチノサイトによるこの炎症性反応は、SCFAによるヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）活性の阻害に関連していると考えられ、HDAC8またはHDAC9を特異的に枯渇させると、SCFA処理と同様の方法でTLR活性化に対する反応が高まることから、SCFAの標的は固有のHDAC（HDAC8およびHDAC9）に関連していると思われた。これらの結果は、特にこれらのHDAC酵素がケラチノサイトにおける過剰なレベルの炎症性遺伝子発現を抑制する役割を担っており、HDAC活性を阻害するSCFAがP. acnesによって生産されると、上皮表面はこれらの常在菌に対する耐性を破ることが示唆された。
