抗USAG-1療法によるBMPシグナル強化による歯の再生
サイエンセス アドバンス
12 Feb 2021
第7巻 第7号
Anti–USAG-1 therapy for tooth regeneration through enhanced BMP signaling
SCISCiENCE ADVANCES
12 Feb 2021
Vol 7, Issue 7
要旨
子宮感作関連遺伝子-1（USAG-1）の欠損は、骨形成タンパク質（BMP）シグナル伝達の亢進を引き起こし、過剰歯の形成につながる。 さらに、USAG-1とBMPとの結合を阻害する抗体が、リポ蛋白受容体関連蛋白質5/6（LRP5/6）ではなく、歯の発育を促進する。 USAG-1はBMPやWntコアセプターLRP5/6に直接結合することで、歯の発生に必須な因子であるWntやBMPシグナルを阻害することから、USAG-1は歯の発生を抑制する重要な調節因子であると考えられた。 しかし、様々なタイプの先天性歯牙欠損症におけるUSAG-1の関与は、未だ不明である。 我々は、USAG-1ノックアウトマウスや抗USAG-1抗体投与によりUSAG-1の機能を阻害することで、様々な遺伝子異常による先天性歯牙形成不全が緩和されることを明らかにした。 この結果は、USAG-1が、野生型マウスや歯のない突然変異マウスにおいて、潜在的な歯胚の発生を阻害することにより、歯の数を制御していることを示している。 したがって、抗USAG-1抗体投与は、歯の再生治療の有望なアプローチである。
くちばし、爪、角、いくつかのエクリン腺と同様に、歯は外胚葉性器官である。 歯の形態形成は、上皮と間充織の相互作用を含むシグナル伝達ネットワークによって制御されている(1-3)。 骨形成タンパク質(BMP)、線維芽細胞増殖因子、ソニックヘッジホッグ、Wnt経路間の正負のループを含む相互作用が、個々の歯の形態形成を制御している(1, 4)。 歯の数は通常、個々の種で厳密に制御されているが(5)、先天的に約1％の個体で増減することがある(6-8)。 通常の歯の数が減少したり増加したりする状態を、それぞれ歯牙形成不全および歯牙過剰と呼ぶ。 マウスモデルの解析により、これらの病態の根底にある遺伝的要因や分子・病理学的メカニズムが明らかにされ始めている(4, 9)。
単一遺伝子ノックアウト（KO）マウスの研究により、Usag-1（Sclerostin domain containing 1 (SOSTDC1)、エクトジン、Wnt modulator in surface ectoderm (WISE)とも呼ばれる）の機能喪失が証明された、 CCAAT/enhancer-binding protein beta (CEBPB)、Sprouty homolog 2 (SPRY2)、Sprouty homolog 3 (SPRY3)、またはEpiprofin (EPFN)は、過剰歯の産生をもたらす(10-14)。 これらの研究結果は、デノボ歯の形成が単一の候補遺伝子によって制御されている可能性を示唆している。 過剰歯は、停止した歯胚のレスキューから生じる可能性がある(10, 15)。我々は以前、USAG-1欠損マウスにおいて、残存乳切歯が過剰歯に変化することを報告した(10)。 USAG-1は、歯の発生に不可欠な2つのシグナル伝達分子であるBMPとWntに拮抗する二機能性タンパク質である(4, 9)。 USAG-1+/-マウスにBMP7を添加した切歯摘出片を移植したところ、過剰歯の発生が誘導されたことから、過剰歯の形成におけるBMPの重要性が示された(16)。 したがって、候補分子の投与は、適切な条件下で全歯の形成をもたらす可能性がある。 さらに、BMPシグナルは過剰歯の形態形成に必須であり(16, 17)、Wntシグナルは過剰歯の形成に重要であることが示唆されている(15, 18)。 しかし、歯の数の決定にBMPシグナル伝達が必要なのか、Wntシグナル伝達が必要なのかは不明である。
無歯症は歯の発育が止まった結果である。 Msx1、Runx2、Ectodysplasin A (EDA)、Pax9 (4,6,7)などの先天性歯牙欠如の原因遺伝子は、主にKOマウスモデルを用いて同定されている(19-24)。 我々は以前、先天性歯牙欠如のモデルマウスであるRunx2-/-マウスで停止した歯牙の発育が、上顎歯牙欠如モデルマウスであるRunx2-/-USAG-1-/-マウスで回復することを報告した(24)。 USAG-1と先天性歯牙形成不全のレスキューとの間に明確な関連性があることは証明されたが、USAG-1の機能を局所的に阻害するだけで歯牙形成不全がレスキューされるかどうかはまだ不明である。 関節リウマチや癌のような様々な疾患に対して、抗体製剤に基づく分子標的薬の臨床応用がますます一般的になってきている（26, 27）。 過剰歯形成の遺伝的メカニズムから、歯の再生のための分子標的治療が実行可能な治療アプローチになり得ることが示唆される。
本研究では、遺伝子的阻害ではなく、抗USAG-1モノクローナル抗体を作製し、歯の発育を局所的に停止させ、回復させることを目的とした。 この目的のために、歯の発生においてBMPシグナルとWntシグナルのどちらが支配的であるかを調べる実験も行った。結果
マウスモデルを用いた歯の形成回復
先天性歯牙欠損と過剰歯のモデルマウスを交配して作製したMsx1-/-USAG-1-/-マウスの表現型の変化を調べた。 上顎と下顎の発育は初期段階で停止していた。 しかし、USAG-1+/+/Msx1-/-マウスでは、さらに口蓋裂が観察された（Fig.） USAG-1-/-/Msx1-/-バックグラウンドのマウスは、理論的には16分の1の確率で子孫を残すはずであったが、USAG-1-/-/Msx1-/-の遺伝子型を持つマウスは151匹中3匹しかいなかった（図1A画像ビューアーで開きます）。 組織学的評価では、すべてのUSAG-1-/-/Msx1-/-マウスが正常な第3上顎臼歯を有していた（図1、HおよびIOを画像ビューアーで開く）。
次に、EDA1-/-/USAG-1-/-マウスを解析した。 EDA1はX染色体上に存在するため、雌のEDA1-/-USAG-1-/-マウスと雄のEDA1+/-USAG-1-/-マウスはUSAG-1とEDA1が欠損している。 これらの二重KOマウスは正常歯、過歯顎、癒合下顎臼歯を有していたが、雌性USAG-1+/+/EDA1-/-マウスおよび雄性USAG-1+/+/EDA1+/-マウスの75%は下顎の臼歯低歯症を有していた（図1、JからR′画像ビューアーで開く、および図S2）。 タビーマウスに見られる典型的な表現型である耳の後ろの脱毛と尾のキンクは、すべてのUSAG-1とEDA1の二重KOマウスに見られた（図1VOpens in image viewer）。 これらの結果は、Usag-1-/-が歯の発生初期に先天性歯牙無形成を救済し、後期に停止した歯牙構造全体の形態形成を促進することを示唆している。
Usag-1中和抗体による歯の欠損の回復と全歯の形成
USAG-1の機能を阻害することで先天性歯牙形成不全が回復するかどうかを調べるために、大腸菌由来の生理活性ヒトUSAG-1リコンビナントタンパク質を抗原として、USAG-1-/-マウスを用いて5種類のマウスUSAG-1モノクローナル抗体（#12、#16、#37、#48、#57）を精製した。 USAG-1は、BMPおよびWntコアセプターLRP5/6に直接結合することにより、WntおよびBMPシグナルを阻害することが示唆されている(28, 29)。 そこで、これら5種類の抗体は、BMPとWntの両方（#57）、BMP（#12と#37）、またはWnt（#16と#48）への結合を阻害する能力に基づいて、3つの異なるクラスに分類した（図2、AおよびBOpens in image viewer）。 すべての抗体がマウスとヒトのUSAG-1リコンビナントタンパク質と結合できることを確認したが（図2、C画像ビューアーで開く）、#16と#48は親和性が低かった（図2、DとE画像ビューアーで開く）。 これらの結果から、歯の数を決定するBMPおよびWntシグナル伝達経路に関するUSAG-1の機能を調べることができた。
図2 5種類のUSAG-1中和抗体（#12、#16、#37、#48、#57）のin vitro解析。
(A）アルカリホスファターゼアッセイで評価した、USAG-1抗体によるBMPシグナル伝達の拮抗活性の中和。 (B）WntレポーターアッセイにおけるUSAG-1抗体によるWntシグナル伝達の拮抗活性の中和。 (C）プルダウンアッセイにおける抗USAG-1抗体とヒト/マウス-PA-USAG-1タンパク質との結合。 (D）FLAGタグ付きヒトUSAG-1タンパク質を発現するヒト胚性腎臓（HEK）293の免疫細胞化学。 (E）マウスUSAG-1タンパク質に対する各USAG-1抗体のKD値。 mAb、モノクローナル抗体；Ab、抗体；DAPI、4′，6-ジアミノ-2-フェニルインドール。
それぞれのUSAG-1中和抗体をEDA1妊娠マウスに全身投与した。 USAG-1中和抗体#12、#16、#48を投与したマウスでは、低い出生率と生存率が観察された（図3A画像ビューアで開く）。 USAG-1中和抗体#16、#37、#48、および#57は、コントロールマウスと比較して、EDA1-/-マウスの下顎の臼歯低歯症を改善した（図3、BおよびCOpens in image viewer、および図S3）。 USAG-1中和抗体#37は高率かつ用量依存的に下顎低歯症を逆転させた（図3BOpens in image viewer）。 さらに、USAG-1中和抗体#12、#16、#37、および#57は、EDA1 KO/heteroマウスの上顎切歯、下顎切歯、または臼歯に過剰歯を産生させた（図3、BおよびCOpens in image viewer、ならびに図S3）。 予想に反して、USAG-1中和抗体#57は、野生型マウスの上顎切歯、下顎切歯、大臼歯に、高率かつ用量依存的に過剰歯の形成を誘導した（図3, Bおよび画像ビューアーのCOpens、図S3）。 しかし、上顎臼歯部では、上顎臼歯の代わりに癒合臼歯が観察された（図3、画像ビューアーのCOpens、図S3）。 いずれの抗体も、少なくともin vitroではBMPシグナル拮抗機能を中和した（図3、BおよびCOpens in image viewer、fig. S3）。 これらの結果は、BMPシグナル伝達がマウスの歯の数を決定するのに必須であることを示している。 さらに、中和抗体を1回全身投与するだけで、歯全体を生成することができる。
Fig. 3 USAG-1中和抗体投与によるEDA1変異マウスの歯の欠損の回復と全歯の再生。
(A）子孫の出生率と生存率。 (B)過剰歯、癒合歯(STとFT)、歯の回復(Rec.)、歯の欠損(Def.)を含む歯の表現型の発生率の要約。 (C)8ヵ月齢マウスの乾燥頭骨における代表的な歯の表現型。 写真提供：京都大学 村島-杉並。
USAG-1中和活性は、BMPシグナル伝達に影響を与えることで歯全体を形成する
USAG-1中和抗体#37および#57のエピトープを決定するために、20個の連続したアミノ酸を含む169個の直鎖ペプチドを用いてエピトープマッピングを行った（図4、AおよびDOpens in image viewer）。 USAG-1中和抗体#37は、Q129EWRCVNDKTRTQRIQLQCQ148領域にまたがる6つの重複ペプチド（D16-D21）と特異的に反応し、エピトープが配列VNDKTRTQRIを含む中央の10残基セグメント内に局在していることを示唆した（図4BOpens in image viewer）。 USAG-1の立体構造は不明であるが、同じBMPアンタゴニストDANファミリーに属するスクレロスチン（SOST）と高い配列相同性を持つことから、SOSTの核磁気共鳴構造を用いてマウスUSAG-1の相同性モデルを構築することができた（図4EOpens in image viewer）(28)。 その結果、抗体#37が認識するエピトープは、USAG-1の中央βシートの表面に露出した端鎖にあることが明らかになり、#37がネイティブUSAG-1を認識する能力と一致した。 この領域は、LRP5/6の結合部位であるNXIモチーフ（図4EOpens in image viewer）(29)から離れたところに位置しており、この抗体はUSAG-1とWntコアセプターLRP5/6との相互作用をブロックしないことを示唆している。 37番の抗体はUSAG-1のWnt1拮抗活性に影響を与えなかった（図2BOpens in image viewer）。 37とは対照的に、抗体#57はUSAG-1由来のオーバーラップペプチドに対して反応性を示さなかった（図4COpens in image viewer）ことから、USAG-1表面に存在する3Dエピトープを認識することが示された。
図4 中和USAG-1抗体#37と#57のエピトープマッピング。
(A）A1からF19までの膜上の14-merペプチドスポットのパターン［1：哺乳動物細胞；2：バキュロウイルス；および3：大腸菌由来の組換えUSAG-1タンパク質；USAG-1抗体（A）＃37および（B）＃57］。 (B) USAG-1抗体#37でプローブしたペプチドアレイ。 (C）USAG-1抗体#57でプローブしたペプチドアレイ。 (E）マウスUSAG-1タンパク質の3次元核磁気共鳴構造モデル。 緑色はUSAG-1抗体#37のエピトープ。 空色はLRP5/6の結合部位（NX1モチーフ）。
内因性Wnt経路阻害剤SOSTは、WntコアセプターLRP6の "E1 "ドメインに結合することで阻害作用を発揮することが確立されている(30)。 前節で述べたように、USAG-1にLRP6結合モチーフNXIが保存されていることから、USAG-1もLRP6の同じドメインに結合することが強く示唆される。 様々な長さのヒトLRP6エクトドメイン断片に対するUSAG-1の結合を評価した。 図5AOpens in image viewerに示すように、LRP6のE1-E2ドメイン断片とUSAG-1の化学量論的結合が観察され、結合部位がE1ドメインにあるという予測を確認した。 対照的に、E1-E4またはE3-E4フラグメントとの結合は観察されなかった。 E1を含むE1-E4断片との結合が見られなかったことは、電子顕微鏡像で高度に湾曲した「C-shape」を示すLRP6のエクトドメイン全体の中で、E1のNXI結合面が閉塞していることから説明できる(31)。 次に、USAG-1中和抗体がLRP6-USAG-1相互作用を阻害するかどうかを調べた。 図5BOpens in image viewerに示すように、抗体#16ではほぼ完全な阻害が観察され、#48では部分的な阻害が観察された。 この所見は、USAG-1のWnt調節活性を阻害する能力と一致していた（図2BOpens in image viewer）。 他の3つの抗体（#12、#37、#57）は、USAG-1とLRP6 E1-E2の結合に影響を与えず、USAG-1のWnt調節活性を阻害できないことを裏付けている（図2BOpens in image viewer）。 これらの結果から、USAG-1のWntシグナルに対する拮抗作用よりも、むしろBMPシグナルに対する拮抗作用を中和することが、マウスの実質的な表現型の変化、すなわち欠損歯の回復や全歯の形成に効果的であると結論した。
図5 全歯を作製するのに十分なUSAG-1中和抗体（#37と#57）は、WntシグナルではなくBMPシグナルの拮抗機能を阻害する。
(A）LRP6の細胞外E1/E2ドメインとマウスUSAG-1タンパク質との相互作用。 (B）USAG-1抗体によるLRP6の細胞外ドメインE1/E2とマウスUSAG-1タンパク質との相互作用の阻害（#16）。 C）BMPアンタゴニストであるDANファミリータンパク質のデンドログラム。 (D）HEK293細胞で発現させたSOSTタンパク質に対するUSAG-1抗体#57の交差反応性。 (E）USAG-1-/-マウスの乾燥した頭蓋骨における下顎大臼歯の表現型。 F）USAG-1抗体（#12、#16、#37、#48、#57）を混合して投与したUSAG-1-/-マウスの乾燥した頭蓋骨における下顎大臼歯の表現型。 白い矢頭は過剰歯を、黒い矢頭は拡大した癒合歯を示す。 Photo credit: A. Murashima-Suginami, Kyoto University.
BMPシグナル伝達に関する抗体#37と#57の機能的差異を調べるため、これらの抗体とDANサブファミリーのメンバーとの交差反応性を解析した（図5COpens in image viewer）。 抗体#57を用いた免疫組織化学では、トランスフェクトしたヒト胚性腎臓（HEK）293細胞でSOSTのシグナルがかすかに検出されたが、#37では検出されなかった（図5D画像ビューアーおよび図S4）。 このSOSTとの弱い交差反応性は、SOSTとUSAG-1の立体構造が似ているためと思われる(28)。 さらに、抗体#12、#16、#37、#48、および#57を含む混合抗体を全身投与すると、USAG-1-/-マウスの下顎における過剰歯の数と癒合歯のサイズが増加した（図5、EおよびFOpens in image viewer）。 これらの結果は、抗体#57がBMPアンタゴニストであるSOSTに作用することで、過剰歯形成の原因となる遺伝的冗長性を抑制している可能性を示唆している。
最後に、非齧歯類モデルにおいて、USAG-1中和活性がBMPシグナル伝達に影響を及ぼし、全歯が形成されることを確認するために、乳歯と永久歯の両方を持つ生後フェレットに抗体#37を全身投与した。 その結果、5倍の高濃度、3回の抗体#37投与、免疫抑制が必要であったが、第3歯列と同様に上顎切歯に上乳歯が形成された（図6、A〜DOpens in image viewer）。 この過剰歯は、永久歯の舌側に位置する通常の永久切歯と類似した形状をしている可能性が高いが、短い歯根が成長しているようであった（図6、E〜GOpens in image viewer）。 したがって、この上顎切歯は第3歯列に分類されるかもしれない(32)。 さらに、上顎切歯の歯髄内には、リン酸化されたSmad陽性細胞が観察された（図6、HおよびIOpens in image viewer）。
図6 USAG-1中和抗体#37を投与したフェレットの上顎切歯の過剰歯。
(A〜D）異なる投与量のUSAG-1中和抗体#37に対するフェレットの上顎切歯。 (E〜G）図6DのマイクロCT画像。 (HおよびI）上顎歯のリン酸化Smad1/5/8（pSmad1/5/8）の免疫局在。 矢印は過剰歯を示す。 IS、免疫抑制。 写真提供：京都大学 村島-杉並。
考察
主にBMPシグナル伝達を阻害するUSAG-1中和抗体（#37および#57）の単回全身投与により、EDA1欠損マウスの歯牙無形成は救済され、野生型マウスでは用量依存的に全歯が効率よく形成された。 我々の知る限り、歯の再生を促進する標的抗体の同定はこれまでに報告されていない。 本研究で作製された抗体は、BMPシグナル伝達に対するUSAG-1の拮抗作用を中和し、LRP5/6の投与量を減らすことで、過剰歯形成を含むUSAG-1ヌルの表現型を救済した(15)。 しかし、数匹のマウスが生まれなかったり、生存しなかったりしたため、これらの知見からWntシグナルの関与を否定することはできない。 したがって、より多くのUSAG-1中和抗体を用いたエピトープビニングや、組換えUSAG-1タンパク質のエピトープの詳細な解析など、さらなる実験が必要である。
我々は、Msx1欠損マウスにおいて、口蓋裂ではなく先天性歯牙無形成の回復と、Msx1やUSAG-1を含むいくつかの原因遺伝子との関連を観察した（図1J画像ビューアで開く）。 BMPシグナル伝達経路のみを標的とするUSAG-1中和抗体の単回全身投与は、EDA1欠損マウスの歯牙形成を回復させたが、この系統に関連する他の表現型には影響を与えなかった。 逆に、USAG-1の阻害は、Wntシグナルは調節するがBMPシグナルは調節しないPax9欠損マウスにおいてのみ口蓋裂の発生を救った(33)。 低分子WntアゴニストもPax9欠損マウスの口蓋裂を改善した(34)。 このことは、USAG-1中和抗体がすべての歯牙欠損症例を治癒させたわけではないが、先天性歯牙欠損症の原因遺伝子の変異が患者選択のためのバイオマーカーとなりうることを示している。 とはいえ、将来の臨床応用のためには、広範な研究が必要である。 EDAはBMP活性を制御し(35)、EDARはWnt標的遺伝子に作用する(36, 37)。 先天性歯牙欠損症は、WntシグナルではなくBMPシグナルに対するUSAG-1中和抗体を投与することにより救済される可能性がある。 さらに、EDA欠損犬において、出生後にEDA作動性抗体を単回全身投与すると、先天性歯牙形成不全が救済された(38)。 USAG-1標的中和抗体の歯牙再生への応用は、特定の原因遺伝子の変異を伴う先天性歯牙形成不全に焦点を当てる必要がある。
さらに我々は、野生型マウスでも全く新しい歯を作る可能性のあるUSAG-1中和抗体を得ることに成功した。 これらのマウスの表現型変化はUSAG-1-KOマウスと類似しており、この抗体がUSAG-1欠損マウスの初生歯原基を救済する可能性が示唆された。 ヒトの歯は、永久歯の大臼歯を除いて、複歯性である(32)。 第一世代（乳歯）と第二世代（永久歯）には、永久歯に加えて初生歯の「第三歯列」が生じることがある(32)。 我々は以前、78人の過剰歯患者の分析に基づき、第3歯列がヒトの過剰歯の原因であることを報告した(32)。 分子標的治療によって第三歯列を刺激することは、歯全体の再生のための有効なアプローチである可能性がある。 本研究では、USAG-1中和抗体の全身投与により、ヒトに類似した歯列パターンを持つ双歯性動物であるフェレットにおいて、第三歯列のような全歯を再生できることを示した。 しかし、この治療法の臨床応用には、フェレットだけでなく、サンカス、イヌ、ブタなどの非齧歯類モデルでのさらなる検討が必要である。
細胞を用いた組織工学を用いた治療法の開発は、再生医療の主流では一般的である。 組織工学的手法を用いた歯牙再生の分野では広範な研究が行われているが（39, 40）、コストや安全性の問題から臨床応用可能な治療法はない。 歯胚を新たに作製することが必要であると考えられているが、今回の調査では、初生歯原基の存在が確認された。 従って、野生型動物においても、新たな歯胚を作製する必要はなかった。 歯原基の成長はUSAG-1によって抑制される。 また、さまざまな遺伝子異常に伴う先天性歯牙形成不全は、歯牙の発育が停止することによって引き起こされる。 このため、従来の組織工学的アプローチは歯の再生には適していない。 本研究の結果は、USAG-1を標的とした無細胞分子療法が、広範囲の先天性歯牙形成不全の治療および第三歯列の誘導に有効であることを示している。
