エビネ 無菌培地phの再検査

先日の寒天培地の作成時にphを測定したが、ph紙のレンジが5.2以下は測定不能だった為、愛媛のSさんのアドバイスで4.0-5.8迄測定出来るGBC ph紙を入手しました。

作成時に塩酸を入れ過ぎて5.2以下にしてしまった(鍋で煮沸した後に塩酸を追加した)懸念があったので、再測定をすることにしました。余分の100ccの寒天培地瓶(加熱処理済)から培地を取り出して測定したところ、測定値は5.6-5.4にあるように見えます。

作成時は5.2以下？だったのに、今は5.6-5.4

で上がっていました。

うーむ、圧力鍋で加熱すると測定値は上がる？それとも、測定ミス？

＜再測定＞

＜作成時＞

左端が塩酸添加により最終調整したPh紙

エビネ 播種(液体培地)の見学

えびね会のTさんから播種の見学の誘いがありました。

私が無菌培養をしたいというので気にかけてくださいました。

播種培地は寒天培地ではなく液体培地を使われています。

＜種子消毒＞

果実に採取日と管理番号を記入したタグを付けてあります。採取後、乾燥させた果実を縦に3片に割ります。白く粉状に見えるのが種子です。

ピンセットで菅瓶にかき落とします。この時、種子の果肉までかくと、ダマになりやすい。

消毒液として次亜塩素酸カルシウムの粉末を水に溶かして上澄みをとった飽和水溶液を使います。

種子を入れた菅瓶に次亜塩素酸カルシウム溶液を入れて、蓋を閉めて振りながら5分間待ちます。

消毒した種子は浮いてきます。

以下、クリーンベンチ内での作業になります。

浮かんだ種子を吸い取らない様にスポイトを菅瓶の底まで入れて消毒液を吸い取り、捨てます。

このスポイトはガラス管を熱し両方に引っ張って細くし、カットして自分で作ったとの事です。

スポイトはアルコールランプで消毒します。ガラスなので何度でも使えます。

次にヤカンに入れた滅菌水を注ぎ、蓋をして降りながら消毒液を洗い流します。

浮いた種子を吸い取らない様にスポイトで滅菌水を吸い取り捨てます。

これを2回繰り返します。

滅菌水は水道水を煮沸したものです。

＜播種＞

菅瓶の周りに付着した種子をピンセットでかき落とし、予め培養試験管 （ニューリップ BT-30）に入れておいた液体培地の中に落とします。

ゴム栓をして、アルミ箔を被せて終わりです。

＜実地指導＞

私にも実地指導をしてくれました。

私がやった培養試験管がわかる様に印を付けてました。生えるかなあ？

家でやってみる様に液体培地入り培養試験管を４本準備してくれました。

ありがとうございます。

Tさんはえびね会の会員（事務局）ですが、春香苑の店主でもあります。

もう長い間交配をやって多くの新花を作出されています。

今年の4月に棚入れしたこの花もTさんの作出花です。

エビネ 培養瓶棚の準備

蘭舎にあるロスチャイルディアナム用の越冬用ガラスケースを培養瓶棚に使う事にしました。

ケース本体からガラス戸を外して全体を水洗いしました。

温室内だと夏場の温度が高くなりすぎるので玄関に移動します。

玄関は夏場の温度が27℃以上にならない様にエアコンをかけています。

100円ショップで買ってきた棚板用の網を敷いてLEDをセットしました。

網の針金が細くちょっと強度が足りていないので補強を考える必要がありそうですね。

ガラス戸をはめて完成です。

これで夏場は最高27℃、冬場はヒーターを入れて最低20℃を維持できます。

８月末には先日作成した培地に、初めての播種を広島のKさんに指導頂きながらトライする予定です。楽しみです。

これで播種した培養瓶を置く準備が出来ました。

培養瓶を置く前に内部をアルコール消毒する予定です。

ロスチャイルディアナムは冬越しのために他の場所を確保しなければいけませんね💦

<Before>

<After>

エビネ 無菌培地の作成(その２）ー 調合、加熱溶解、殺菌

培地作成作業を1000ccずつ２回に分けて行いました。

目標は100ccの瓶培地20本です。

2週間後のコンタミがどのくらい出るか、初めての作業なので不安です。

歩留まり半分で、使えるのは10本です。

もっとも今年は果実2本を播くだけなのでそれで十分なのですが。

計量カップに1000ccの水を入れ、愛媛のSさんから送って頂いた調合済みの培地を入れます。活性炭、ビタミン剤も入れよくかき混ぜます。活性炭とビタミンはえびね会のTさんから頂きました。これをアルミ鍋に移して、ヘラでかき混ぜながら沸騰する迄温めます。（沸騰しなくても良いが、沸騰した方が寒天が固まりやすいそうです）

調合済培地（ビニール袋入り;水1000ccに必要なハイポ、ペプトン、トレハ、クラュー、寒天を混合したもの)、活性炭、ビタミン剤　　＜失敗談１あります＞

へラを使って焦げ付かない様によくかき混ぜながら加熱溶解します。

＜失敗談２あります。＞

次にphを測定し、5.2（種まき培地）に調整します。

デスボーサルスポイトで塩酸を加えながら、その都度測定(4回)しました。

１回目（右端）は、無調整で測定しました。ph 6.1

２回目（右から2番目）塩酸35％を1滴追加

３回目（右から3番目）塩酸35％を2滴追加

４回目（右から4番目）塩酸35％を3滴追加

少し低くしすぎたかもしれません。＜失敗談３あり＞

本にはph値を下げる場合は塩酸、上げる場合は苛性ソーダを加えるとの記載がありますが、殆どの場合は調合した培地のph値は5.2より高く、塩酸35%を1、2滴加えればよい。塩酸を入れすぎなければ苛性ソーダは不要とのアドバイスを頂きました。不要な苛性ソーダを準備しなくて済みました。

予め消毒しておいた空瓶に、漏斗を使って瓶の周りに培地が付着しない様に100ccずつ注入します。

この作業も瓶にマジックで100㏄の目盛りを付けて、注ぎやすいようにステンレスのヤカンで行いました。

瓶蓋を緩めにしめて、圧力鍋に4個入れます。

鍋の蓋を閉めて低圧（113℃）で30分間煮沸しました。

一度にマヨネーズ瓶が4本入ります。＜失敗談４あり＞

この圧力鍋はパール金属（株）のH-5437で5.5L(8合焚き）です。

高圧（118℃）、低圧（113℃）の2段階切り替えができます。

加熱殺菌後、自然冷却を待って培養瓶を取り出します。

少し緩めていた蓋をしっかりと締めます。

今回はキッチンパックに一瓶づつ包みました。

結局20本作るつもりが、失敗続きで９本しか出来ませんでした。

コンタミを心配する以前の問題でした💦

以下、失敗談です。

＜失敗談１＞

活性炭は粉末が必要です。ネットでオーダーした活性炭は破砕炭でそのまま混入しても溶けないことが直前にわかりました。

なあーんも考えてないんですねえ、わたくし(^^;

＜失敗談２＞

調合した培地を鍋に掛けて熱を加えて溶解します。本ではホウロウの鍋と書いてありますが、瓶に注ぎ易い様に、ステンレス製のヤカン(容量2リットル)を準備しました。瓶に注ぎ終わったときにヤカンの底面にゲル状の焦げを見つけました。

この程度の焦げが出来ると、エビネは生えないそうです。１回目の瓶１０本は全て廃棄しました。

原因は火力が強過ぎたこと、ゴムかシリコンのヘラを使って鍋底を拭くようにかき混ぜなかったこと、ヤカンの底が薄く熱が伝わりやすいので焦げやすかったこと、寒天が焦げやすい粘性のあるものとの認識が欠落していたこと。等

＜失敗談３＞

ph調整のために準備したph紙の測定レンジが（目盛り）が荒すぎたと思います。未調整でどの程度の数値を示すか等の経験が無かったので5.2付近を計れるBCG ph紙を適当に購入したのが敗因(^^;

次回は4.0-5.6の間を0.2単位で読むことが出来る下の写真のBCG ph紙を用意します。

＜失敗談４＞

圧力鍋に水を入れ過ぎて、培養瓶が傾いたまま寒天が固まってしまいました。

また、１瓶だけ横に寝て瓶内に水が入りました。

針金で４瓶が固定できる枠を作ろうと思います。

この作業もえびね会のTさん、広島のKさん、愛媛のSさんに電話、メールやライン等で指導を受けながら行いました。みなさん有難うございました。

エビネ 無菌培地の作成（その１）ー 培地の材料の準備

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播種培地の材料となるペプトン、寒天や薬品等を準備します。

エビネの育種技術・無菌培養が記載された本「エビネの人口交雑種」に基づいて無菌培養に必要な器材や薬品等を準備します。

この本は無菌培養を行っている育種家のバイブル的な本だそうです。

培地の材料や量、調合の方法はもちろん、無菌培養全体の事が書かれています。

本には多くの情報がありますが、いつ迄に何をどの様にしたら良いか？材料は分かっても製品名や入手先は何処か？具体的な手順等はどうするか？等、読んでも分からない事もあり、愛媛のSさんに培地の作り方が分からないので教えてほしいと尋ねたら、調合済みの培地を送ってくれました。

（来年までには自分で準備できるようにし、今回はお言葉に甘えました。）

水1リットル分を1セットとして2セット分です。

粉末ハイポ

グラニー

トレハロース

ペプトン

寒天

但し、本に記載されているビタミン剤は入ってないとの事でした。

ビタミン剤無しでも生えるには生えるが、特にニオイの場合は発芽が少なくなるとの話もあり、えびね会のTさんに相談したところ、Tさんが使っているビタミン剤を1セット 2ml/水1000ccで2セット分を頂きました。

Tさんは作成したビタミン剤を2mlずつ小分けにして冷凍保存しているそうです。

合わせて、お二人には必要な機器、薬品他の商品名、購入先の情報等を教えて頂きながら来年の為の準備として平行して調達を進めています。

Sさん、Tさんありがとうございました。

エビネ 培養瓶の消毒と瓶蓋の準備

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培養瓶はマヨネーズ瓶450mlを使います。

この瓶は愛媛のSさんのラボを見学した時に頂きました。

培地注入前に水洗いし、キッチンハイターで消毒します。

今回は使用済みのプラ鉢を消毒するついでにケミクロンGにも浸けて見ました。

ケミクロンGは次亜塩素酸カルシウムなので、ガラス面に付着して白く曇るのでキッチンハイターの方が良いとの事です。

瓶蓋はモノタロウで調達しました(1077円/24個)が、ホームセンターでも買えるそうです。

蓋には直径1〜5mmの通気口を開けて、シールします。

穴は焼いた針で簡単に開くそうですが、今回は2mmのドリルを使って開けました。

シールはグリーンバイオからGBフィルター(500枚/10,000円)を取り寄せ貼付しました。

＜使用済瓶の消毒；ケミクロンG＞

＜使用済瓶の消毒；キッチンハイター＞

＜通気口の穴あけとGBフィルターによるシール＞

エビネ 初めての無菌培養

洋ランに夢中になっていたころ、行きつけの洋蘭栽培業者さんで、無菌培養のラボを見たことがありました。試験管の中にプロトコムが育ち、自動で攪拌されていた記憶があります。いつの頃からは定かでないですが蘭の花を交配して自分だけの花を咲かせてみたいと思うようになっていました。

仕事に忙殺されていた当時はその夢もかなう筈もなく、蘭の趣味さえ断念せざるを得ませんでした。

やっと時間が取れるようになり趣味を再開すると、その夢もまた少しずつ膨らんできました。

当初は蘭の種類にこだわる事なく、蘭なら何でも良いかなと思っていましたが、寒蘭、春蘭は難しいと聞いたこともあって、エビネに興味が出て来た頃からやるならエビネかなと思い始めました。

高知のKさんから頂いた瓶苗を順化させて4年後に初花を見た時の感激は忘れられず、交配はほぼエビネに傾きました。

(Kさんからは順化の方法から花が咲くまでの4年間、随時電話で色々なアドバイスを頂きました。)

園芸JAPANのニオイエビネの記事を読む度にニオイエビネの魅力に引き込まれ、遥か昔、通勤途中に浜松町の改札口階段下で無造作にな新聞にくるんで売られていたブルーやピンクの香りの良いエビネがニオイエビネだったことを知りました。

趣味家のブログでニオイエビネの交配なをやっている記事を見て、自分もニオイの交配をやってみたいと決めました。昨年2022年の春のことです。

しかし、交配の知識もある訳ではなく、エビネの蘭友もいなかったので、教えを乞う為に趣味家のブログにコメントをしたりしましたが、何処の誰かも分からない怪しい奴からの変なメールには答えていただけないのは、今のご時世では当然の事でした。

そんな時、地元の植物園で展示会を開催していたえびね会を知り交配をやりたい旨をお伝えし入会をお願いしました。発足5年目の若いえびね会で私が入会した時は私を含めて総勢7人(内女性2人)でした。とは言え、会長は知る人ぞ知るエビネ歴40年のYさん、事務局は趣味が高じて？新しくエビネ園を起業した（交配もしています）Tさん、他のメンバーもエビネが大好きな方ばかりでした。

それと平行して、自然種ニオイエビネ同士の交配をされている広島県のKさんと縁が出来、愛媛のSさんや高知のKさんの力添えもあって、初めての無菌培養の世界に足を踏み出す事になりました。

交配から開花まで数年かかる事を思えば、当方に残された時間も充分とは言えませんが可能な限り、カテゴリー「無菌培養」で記録を残そうと考えています。

ご指導を頂く無菌培養の色々なノウハウや培地の調合等は長年の研究結果で得たものだったり、企業秘密?だったりして許可なく公開でき無いものもあるかと思います。

可能な範囲で記録してみたいと思います。

このブログは自分の為の蘭の育成記録を目的にしていますが、これから無菌培養をトライする方に少しでも参考になればと思います。

果たしてどうなることやら？？？

乞うご期待💦

＜交配した御蔵信青＞

ニオイエビネ 「御蔵信青」の採果

あれから、2週間、果実を採取しました。

4/8交配なので8/12で18週126日を過ぎました。

採取した果実は、封筒に入れて室温で乾燥させます。

乾燥剤も入れています。

ニオイエビネ 「御蔵信青」の交配 その後(2)

あれから1ヶ月。

交配から16週、112日を経過した。

お盆ごろには果実を採取出来る筈ですが、ここに来て母木の後木の葉が急に黄変して来ました。

この暑さでジワジワとダメージが来始めているのかもしれない。

採取までもう少し頑張って欲しい。

ニオイエビネ 「御蔵信青」の交配 その後(1)

あれから1ヶ月、交配後80日を経過した。

花茎の黄変も種子の直ぐ上で止まり、何とかポロリは免れたようだ。

種子も前よりも膨らんで来た。

「エビネコレクション」さんのブログに種子の腐りを予防する為にダコニール原液を塗布する記事があったので真似て見た。

<2023.6.29>撮影

ニオイエビネ 「御蔵信青」の交配

棚入れした「御蔵信青」の第1花に「青嵐」、第2花に「御蔵蛍青」を交配した。

初めての経験なので、広島のKさんに花粉の採り方、受粉の仕方を丁寧に指導して貰った。

どの様に花(子房)が変化するか比較の為、受粉させていない第3花も残して、残りの花を除去した。

<2023.04.10>

交配2日後

まだ、何の変化もありません。

<2023.04.12>

4日後

変化なし。ネットで調べると2、3日で花弁が萎れてくると書いてあった。

<2023.04.18>

10日後

子房がやや膨らんで来たか。

花も下を向いて花弁の色も褪せてきた。

<2023.04.22>

14日後

子房が膨らんできたのがハッキリと分かる。

花弁も萎んだ。

第3花と比べると違いがハッキリと確認出来る。

結実は間違いなさそうだ。

<2023.05.08>

比較の為に残していた第3花を除去しました。

<2023.05.28>

交配50日後

子房は大きく膨らんで来ました。

花茎が頂部から黄変して、子房の上まで降りて来ました。

黄変は止まるのだろうか？それともポロリ？😢

順調に行けば、2ヶ月半後には収穫か。

ソロソロ次のステップのお勉強&準備をしないといかんなぁ💦

「日立 クリーンベンチ」の入手

ヤフオクでクリーンベンチを落札した。

エビネの無菌培養に挑戦したいと思い始めたからです。

無菌箱を自作したかったのだが、全く見当がつかないので、ヤフオク出品通知を「クリーンベンチ」でONにしていた。

旧式だが、日立製の本格的なクリーンベンチで、作動確認はガスバーナを除いて問題なかった。

ガスバーナはガスボンベを接続しないと出来ないので、使用が近づいたらやることにしよう。

出品者の友人が植物の無菌培養に使用していたとの事だった。