KEK（高エネルギー加速器研究機構）の公開講座に行って、タンパク質の構造解析方法を聴いてきた！

６月３日は、つくばのKEK（高エネルギー加速器研究機構）に行って、

タンパク質の構造分析方法について聞いてきた！

ノーベル化学賞受賞の“クライオ電子顕微鏡“で分子と生命をつなぐ｜つくば開催 [送迎バスあり]・参加無料

ので、その内容をメモメモ

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【第一話】分子と生命

・ナノ世界への道

　根本的な疑問「なぜニワトリは鶏に育つのか？」

　昔は２つの説

　　　前成説：精子の中に小人がいて、大きくなる

　　　後成せt：素があって混じる

　ミクロの世界へ

　　　１７C　顕微鏡ができて流れ変わる

　　　　　　　生物は細胞からできている（フック）

　　　　　　　微生物は卵から産まれてくる（レーウェンフック）

　　　１８３８，３９生物の基本単位は細胞（シュライデン）

　遺伝子の概念

　　　メンデル　遺伝の法則（エンドウ豆）→遺伝物資tがわからないときに

　　　遺伝子型と表現型

　　　　対応付けられるけど、仕組みはわからない

　　　アベリー　遺伝物資はDNA

　　　ワトソンとクリック　二重らせん（１９５３）

　　　遺伝子とタンパク質　アミノ酸のつなげ方→遺伝子

　　　　　セントラルドグマ：DNA→ｍRNA→タンパク質

　　　人のタンパク質：

　　　　　２３０００程度のタンパク質の設計図がDNAに

　　　　　（修飾とかもあって、タンパク質は１０万）

　　　タンパク質

　　　　　立体構造：きまった形を持っている

　　　　　→形が働きを決める

　　　　　　熱すると形が壊れ、働きが失われる

　　　タンパク質の働き

　　　　　　化学反応を触媒する（酵素）

　　　　　　情報を伝達する（シグナル分子）

　　　　　　動く（筋肉）

　　　　　　外部刺激に反応（受容体）

　　　　→生化学

　　　化学の言葉で生物を語る

　タンパク質の構造を見る

　　　方法３つ

　　　・MX　　X線結晶構造解析

　　　　NMR　核磁気共鳴法

　　　　Cryo-EM 極低温電子顕微鏡法（クライオ電顕）

　　　　　　→１０年前のブレイクスルー

　　　PDBデータベース

　　　　　２０万以上のタンパク質の構造登録→３０年前は３００個くらい

　X線構造解析

　　　・解析対象のタンパク質を決める

　　　・大腸菌に作らせる（発現）

　　　・純度の高いもの（純品）に精製する（精製）

　　　・結晶を作り（結晶化）

　　　・X線をあてる（回析データ測定）

   X線構造情報を使う実際の研究

　　　エネルギーを融通（ためて使う）：ATP　１日４０Kg

　　　GTP：どうやって使われるのか？

　　　　→GTPの量を測るタンパク質PI（５）Pの量に変換

　【質問のキーワード】

　　・分子動力学

　　・AlphaFold（アルファフォールド）：タンパク質の構造予測 

　　・精製の例：ヒスチジンつけるとニッケルにつくこと利用

　　　　　→タグ付け

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クライオ電子顕微鏡で生き物のb品の形を「分子の世界」で明らかにしよう

　生き物の内部を３次元で見たい！

　　　見たい部分を切り開く→人や動物だと困る

　　　　　→物を透過する特別な信号を使う

　　　　　　　X線→CTスキャン→X線構造解析

　　　　　　　ラジオ波→MRI→NMR

　　　　　　　電子　　　　　→クライオ電顕

　電顕で生き物を見る問題

　　　真空中で見ないといけない→タンパク質壊れる

　　　→そこでクライオ電顕　　　クライオ：とっても冷たい

　　　ものを、とても低い温度で（ー１９６度）で冷やしたまま撮影

　　　→うすい膜上の溶液の膜に入れる：壊れにくくなる

　　　ここ数年で小さいものが見られるようになった。

　　　　→分解能革命：ブレイクスルー３つ

　　　　　　　・カメラ

　　　　　　　・画像解析（アルゴリズム、計算機）

　　　　　　　・試料調整方法

　クライオ電顕を使ってタンパク質の３次元構造マップを得る手順

　　　・クライオ電顕でタンパク質粒子の２次元画像を撮影

　　　　　　同じタンパク質の粒子をたくさんのガラス状の氷に埋め込む

　　　　　　　　グリッド→グリッドスクエア→ホール（１μｍ）に入れる

　　　　　　タンパク質の動画撮影→振れ補正

　　　・個々のタンパク質の洗い出し

　　　　　　いろんな方向むいているので、いくつかのグループに分けて

　　　　　　　　まとめる

　　　　　　まとめたものを平均化→ノイズなくす

　　　・２次元粒子の画像のスタック→３次元構造マップ

　　　　　　→タンパク質粒子の姿勢を計算

　　　　※撮影像

　　　　　　　ラドン変換：３次元を２次元にする

　　　　　　　逆ラドン変換：２次元から３次元にする（いろんな角度必要）

　　　　３次元の角度を決める方法

　　　　　プロジェクトマッチング法（投影像適合法）

　　　　　　　※（精度が悪い）３次元マップがあったとする

　　　　　　（１）（精度が悪い）３次元マップを計算でラドン変換して

　　　　　　　　　　各角度における２次元投影像を作る

　　　　　　（２）（１）で作った画像と、撮影した２次元画像を比較し、

　　　　　　　　　　一番似ているものを選ぶ→ここで撮影画像の角度きまる

　　　　　　（３）（２）で２次元画像と角度が決まったので、

　　　　　　　　　　逆ラドン変換して、３次元マップを得る

　　　　　　　　→※に戻る（繰り返す）

　　　　　なお、この方法だと、はじめの※の画像がないので困るが、

　　　　　それはランダムに割り当てr

（おまけ）構造決定したあと

　　・写真で手に持っているのは、３次元構造のモデル（模型）

　　　　→３次元構造マップがら３Dプリンタで作成する

【質問】

　　２次元画像をどれだけ使う？

　　　　撮影状況が良い場合１万で済むこともあるが、

　　　　そうでない場合２０万

　　

　　”個々のタンパク質の洗い出し

　　　　　　いろんな方向むいているので、いくつかのグループに分けて

　　　　　　　　まとめる”

　　　→どのくらいのグループ

　　　１００～２００。あまり分けすぎると、平均化する画像が少なくなり、

　　　ノイズが消えなくなる